GPC3特异的siRNA筛选和对肝癌细胞增殖能力的影响(2)
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参见附件。
1.6?Western Blot
细胞收集后用PBS洗涤2次，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA buffer(1X PBS，1% NP-40，0.1% SDS，5 mmol/L EDTA， 0.5%脱氧胆酸钠和1 mmol/L正钒酸钠)裂解细胞。蛋白样品定量后，于8% SDS-PAGE上进行分离，并电转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉溶液进行封闭。加入稀释到合适浓度的GPC3和GAPDH一抗，于4℃孵育过夜进行免疫杂交。然后加入HRP标记的抗兔二抗，最后加入West Femto化学发光检测底物(PIERCE)进行反应，显影检测。
1.7?细胞增殖检测
培养细胞到汇合度达80%左右时，按EdU Apollo DNA in vitro Kit(锐博)说明书每孔加入100 μL含50μmol/L EdU培养基孵育2 h；弃培养液，每孔加入100 μL细胞固定液(含4%多聚甲醛的PBS)室温孵育15～30 min，再加入2 mg/mL甘氨酸孵育10 min；PBS冲洗，每孔加入100 μL渗透剂(含0.5% TritonX-100的PBS)透化细胞；加入100 μL的1X Apollo染色反应液，避光、室温孵育30 min；加入100 μL 1X Hoechst 33342反应液，避光、室温孵育10～30 min；洗脱Hoechst33342反应液，荧光显微镜观察。
1.8?统计学方法
采用SPSS17.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差()表示。荧光定量PCR和免疫蛋白印迹检测实验采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各组间差异 ......
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