七氟烷预处理对老年大鼠心肌线粒体敏感性钾通道的影响(2)
【Key words】 Sevoflurane preconditioning； Ischemia myocardial； Myocardial mitochondria
First-author’s address：Qingyuan People’s Hospital，Qingyuan 511518，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.03.007
心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是指缺血心肌恢复血供后出现更为严重的心肌功能损伤，是临床麻醉工作中常见的病理生理过程，尤其心脏手术中多见[1]。大量的临床和实验研究均表明，给予七氟烷在心肌缺血或复灌注之初，可诱导产生与缺血预处理或缺血后处理类似的保护效果，从而减轻心肌缺血损害的程度[2-4]。本研究通过建立大鼠缺血再灌注模型，给予七氟烷预处理，观察其对缺血再灌注大鼠心脏功能及大鼠心肌线粒体结构的影响，旨在探讨七氟烷预处理对MIRI的保护作用及其可能机制。现报道如下。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 实验动物及离体心脏灌注模型的建立 清洁级健康雄性SD大鼠60只，20～24月龄，体重320～370 g，由清远市人民医院实验动物中心提供。腹腔注射肝素对大鼠进行肝素化处理，30 min后，腹腔注射戊巴比妥钠5 mL/kg用以麻醉大鼠。麻醉成功后，将大鼠置于实验台上并固定，寻找解剖标志剑突，沿胸骨下缘剪开胸腔，打开心包，暴露主动脉弓。沿心底部迅速横断主动脉，将心脏取出并迅速放于4 ℃的无钙台式液中，轻轻挤去心腔中的残余血液，游离主动脉根部。将离体心脏悬挂于灌注装置上，经主动脉泵入饱和台式液。整个灌注装置提前使用循环水浴箱进行预热，心脏的温度控制为(37±5)℃[5-10]。
1.2 实验动物分组 60只大鼠，制备离体心脏灌注模型，经KH平衡液平衡15 min后随机分成以下6组，每组10只。(1)假手术组：平衡后继续灌注KH液75 min；(2)缺血再灌注(I/R)组：平衡后灌注20 min，之后全心停灌25 min，再灌注30 min；(3)七氟烷预处理Ⅰ(Sevo Ⅰ)组：平衡期后使用0.5 Mac七氟烷饱和的KH液后处理15 min，普通液洗脱5 min，停灌25 min，再改为KH液灌注30 min；(4)七氟烷预处理Ⅱ(Sevo Ⅱ)组：平衡期后使用1.0 Mac七氟烷饱和的KH液后处理15 min，普通液洗脱5 min，停灌25 min，再改为KH液灌注30 min；(5)Sevo Ⅰ+5-HD组：平衡后使用0.5 Mac七氟烷饱和5-HD(100 μm)的KH液后处理15 min，普通液洗脱5 min，停灌25 min，再使用KH液灌注30 min；(6)Sevo Ⅱ+5-HD组：平衡后使用1.0 Mac七氟烷饱和5-HD(100 μm)的KH液后处理15 min，普通液洗脱5 min，停灌25 min，再使用KH液灌注30 min。
, http://www.100md.com
1.3 心功能指标测定 稳定后切开左心耳，经左心房、二尖瓣，将连接测压导管的球囊送入左心室，测压导管的另一端连接多导生理记录仪。分别在平衡后，缺血前，再灌注5、15、30 min时测定冠脉血流量(coronary flow，CF)、心率(heart rate，HR)、左室发展压(left ventricular developed pressure，LVDP)和左室舒张末压(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)。
1.4 心肌线粒体的形态学观察 再灌注末取心肌标本，采用差速离心法提取胞浆膜下线粒体(subsarcolemmal mitochondria，SSM)、心肌纤维间线粒体(intermyocardial fiber mitochondria，IFM)，在高倍电子扫描显微镜下观察两种线粒体的形态学变化[11-13]。
1.5 统计学处理 采用SPSS 12.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用(x±s)表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 六组离体心脏缺血前后CF比较 平衡后和缺血前，六组离体心脏CF比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。再灌注5、15、30 min，除假手术组外其他五组CF均低于缺血前及平衡后(P<0.01)；Sevo Ⅰ组与Sevo Ⅱ组CF均高于I/R组(P<0.01)；Sevo Ⅱ組CF均高于Sevo Ⅰ组(P<0.01)；Sevo Ⅰ+5-HD组CF均低于Sevo Ⅰ组(P<0.01)；Sevo Ⅱ+5-HD组CF均低于Sevo Ⅱ组(P<0.01)。见表1。
2.2 六组离体心脏缺血前后HR、LVDP、LVEDP比较 平衡后和缺血前，六组离体心脏HR、LVDP、LVEDP比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。再灌注5、15、30 min，除假手术组外其他五组HR、LVDP均低于缺血前及平衡后(P<0.01)，LVEDP均高于缺血前及平衡后(P<0.01)；Sevo Ⅰ组与Sevo Ⅱ组HR、LVDP均高于I/R组(P<0.01)，LVEDP均低于I/R组(P<0.01)；Sevo Ⅱ组HR、LVDP均高于Sevo Ⅰ组(P<0.01)，LVEDP均低于Sevo Ⅰ组(P<0.01)；Sevo Ⅰ+5-HD组HR、LVDP均低于Sevo Ⅰ组(P<0.01)，LVEDP均高于Sevo Ⅰ组(P<0.01)；Sevo Ⅱ+5-HD组HR、LVDP均低于Sevo Ⅱ组(P<0.01)，LVEDP均高于Sevo Ⅱ组(P<0.01)。见表2～4。
2.3 线粒体电镜结果 假手术组的正常线粒体：线粒体提取丰度较高，数目较多，线粒体形态完整，嵴清晰，少有肿胀，SSM和IFM无明显差别。Sevo Ⅰ组、Sevo Ⅱ组线粒体：IFM线粒体数目较多，形态完整，嵴清晰部分有空泡、肿胀，少数破坏；SSM线粒体数目较IFM少，大多形态完整，嵴较为清楚，部分有肿胀、空泡。I/R组、Sevo Ⅰ+5-HD组、Sevo Ⅱ+5-HD组线粒体：IFM线粒体数目明显减少，线粒体中度肿胀，部分嵴排列紊乱、不清楚，变性甚至破裂；SSM线粒体数目减少明显，残存线粒体多肿胀，基质丢失，视野充满线粒体碎片。, 百拇医药(张斌 林宗航 何江)
First-author’s address：Qingyuan People’s Hospital，Qingyuan 511518，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.03.007
心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是指缺血心肌恢复血供后出现更为严重的心肌功能损伤，是临床麻醉工作中常见的病理生理过程，尤其心脏手术中多见[1]。大量的临床和实验研究均表明，给予七氟烷在心肌缺血或复灌注之初，可诱导产生与缺血预处理或缺血后处理类似的保护效果，从而减轻心肌缺血损害的程度[2-4]。本研究通过建立大鼠缺血再灌注模型，给予七氟烷预处理，观察其对缺血再灌注大鼠心脏功能及大鼠心肌线粒体结构的影响，旨在探讨七氟烷预处理对MIRI的保护作用及其可能机制。现报道如下。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 实验动物及离体心脏灌注模型的建立 清洁级健康雄性SD大鼠60只，20～24月龄，体重320～370 g，由清远市人民医院实验动物中心提供。腹腔注射肝素对大鼠进行肝素化处理，30 min后，腹腔注射戊巴比妥钠5 mL/kg用以麻醉大鼠。麻醉成功后，将大鼠置于实验台上并固定，寻找解剖标志剑突，沿胸骨下缘剪开胸腔，打开心包，暴露主动脉弓。沿心底部迅速横断主动脉，将心脏取出并迅速放于4 ℃的无钙台式液中，轻轻挤去心腔中的残余血液，游离主动脉根部。将离体心脏悬挂于灌注装置上，经主动脉泵入饱和台式液。整个灌注装置提前使用循环水浴箱进行预热，心脏的温度控制为(37±5)℃[5-10]。
1.2 实验动物分组 60只大鼠，制备离体心脏灌注模型，经KH平衡液平衡15 min后随机分成以下6组，每组10只。(1)假手术组：平衡后继续灌注KH液75 min；(2)缺血再灌注(I/R)组：平衡后灌注20 min，之后全心停灌25 min，再灌注30 min；(3)七氟烷预处理Ⅰ(Sevo Ⅰ)组：平衡期后使用0.5 Mac七氟烷饱和的KH液后处理15 min，普通液洗脱5 min，停灌25 min，再改为KH液灌注30 min；(4)七氟烷预处理Ⅱ(Sevo Ⅱ)组：平衡期后使用1.0 Mac七氟烷饱和的KH液后处理15 min，普通液洗脱5 min，停灌25 min，再改为KH液灌注30 min；(5)Sevo Ⅰ+5-HD组：平衡后使用0.5 Mac七氟烷饱和5-HD(100 μm)的KH液后处理15 min，普通液洗脱5 min，停灌25 min，再使用KH液灌注30 min；(6)Sevo Ⅱ+5-HD组：平衡后使用1.0 Mac七氟烷饱和5-HD(100 μm)的KH液后处理15 min，普通液洗脱5 min，停灌25 min，再使用KH液灌注30 min。
, http://www.100md.com
1.3 心功能指标测定 稳定后切开左心耳，经左心房、二尖瓣，将连接测压导管的球囊送入左心室，测压导管的另一端连接多导生理记录仪。分别在平衡后，缺血前，再灌注5、15、30 min时测定冠脉血流量(coronary flow，CF)、心率(heart rate，HR)、左室发展压(left ventricular developed pressure，LVDP)和左室舒张末压(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)。
1.4 心肌线粒体的形态学观察 再灌注末取心肌标本，采用差速离心法提取胞浆膜下线粒体(subsarcolemmal mitochondria，SSM)、心肌纤维间线粒体(intermyocardial fiber mitochondria，IFM)，在高倍电子扫描显微镜下观察两种线粒体的形态学变化[11-13]。
1.5 统计学处理 采用SPSS 12.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用(x±s)表示，比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 六组离体心脏缺血前后CF比较 平衡后和缺血前，六组离体心脏CF比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。再灌注5、15、30 min，除假手术组外其他五组CF均低于缺血前及平衡后(P<0.01)；Sevo Ⅰ组与Sevo Ⅱ组CF均高于I/R组(P<0.01)；Sevo Ⅱ組CF均高于Sevo Ⅰ组(P<0.01)；Sevo Ⅰ+5-HD组CF均低于Sevo Ⅰ组(P<0.01)；Sevo Ⅱ+5-HD组CF均低于Sevo Ⅱ组(P<0.01)。见表1。
2.2 六组离体心脏缺血前后HR、LVDP、LVEDP比较 平衡后和缺血前，六组离体心脏HR、LVDP、LVEDP比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。再灌注5、15、30 min，除假手术组外其他五组HR、LVDP均低于缺血前及平衡后(P<0.01)，LVEDP均高于缺血前及平衡后(P<0.01)；Sevo Ⅰ组与Sevo Ⅱ组HR、LVDP均高于I/R组(P<0.01)，LVEDP均低于I/R组(P<0.01)；Sevo Ⅱ组HR、LVDP均高于Sevo Ⅰ组(P<0.01)，LVEDP均低于Sevo Ⅰ组(P<0.01)；Sevo Ⅰ+5-HD组HR、LVDP均低于Sevo Ⅰ组(P<0.01)，LVEDP均高于Sevo Ⅰ组(P<0.01)；Sevo Ⅱ+5-HD组HR、LVDP均低于Sevo Ⅱ组(P<0.01)，LVEDP均高于Sevo Ⅱ组(P<0.01)。见表2～4。
2.3 线粒体电镜结果 假手术组的正常线粒体：线粒体提取丰度较高，数目较多，线粒体形态完整，嵴清晰，少有肿胀，SSM和IFM无明显差别。Sevo Ⅰ组、Sevo Ⅱ组线粒体：IFM线粒体数目较多，形态完整，嵴清晰部分有空泡、肿胀，少数破坏；SSM线粒体数目较IFM少，大多形态完整，嵴较为清楚，部分有肿胀、空泡。I/R组、Sevo Ⅰ+5-HD组、Sevo Ⅱ+5-HD组线粒体：IFM线粒体数目明显减少，线粒体中度肿胀，部分嵴排列紊乱、不清楚，变性甚至破裂；SSM线粒体数目减少明显，残存线粒体多肿胀，基质丢失，视野充满线粒体碎片。, 百拇医药(张斌 林宗航 何江)