Ad-Egr-hTrail联合放射线对脑胶质瘤细胞杀伤作用的实验性研究(2)
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1 资料与方法
1.1 一般资料 携带人TRAIL基因的增殖缺陷型腺病毒重组载体Ad-Egr-hTrail及Ad-CMV-hTrail为上海交通大学医学院生物化学教研室葛盛芳博士惠赠，U251脑胶质瘤细胞株购自中科院生物细胞学研究所。MTS检测试剂盒(Promega)； DMEM培养基(GIBCO)。PCR反应试剂盒(Fermentas公司)； 100bp Marker(天为时代公司)；引物序列由上海生物工程公司合成：
上游引物(P1)： 5＇-GCTGCCTGGCTGACTTACA-3＇，下游引物(P2)： 5＇-TGGCTGGTCTAGACAGATTGC-3＇，扩增片断为1037bp。
1.2 实验方法
1.2.1 重组腺病毒的扩增 、纯化和滴度测定
将携带Ad-Egr-hTrail的293包装细胞从-70℃冰箱取出，-70℃/37℃反复冻融3次，以裂解细胞，释放重组病毒。将上述细胞裂解液移至离心管中，12000rpm，离心10 min。吸取含病毒的上清液，感染AE25 crma细胞，大量扩增重组腺病毒。Ad-CMV-hTrail扩增方法同上。然后纯化及滴度测定。
1.2.2 重组腺病毒的PCR鉴定
为了检测重组腺病毒是否携带目的基因Trail，裂解腺病毒,提取重组病毒基因组 DNA，以上述病毒DNA为模板，加入引物P1和P2于 PCR反应体系，进行PCR反应。PCR反应条件：先95℃预变性5 min； 接着94℃ 1 min；60℃1 min； 72℃ 90 s；再72℃ 延伸10 min,共30个循环。
1.2.3 实验分组
实验分成6 组：空白对照组， Ad-Egr-hTrail组(Egr组)，Ad-CMV-hTrail组(CMV组)，Ad-Egr-hTrail+照射组(Egr+照射组)，Ad-CMV-hTrail+照射组(CMV+照射组)，单纯照射组。
1.2.4 病毒感染
取指数生长期的U251细胞，接种在96孔细胞培养板中，1×104细胞/孔，每孔100 μl，每组设4个复孔，48 h后用移液器先将培养板内培养液吸尽,然后每孔加入50 μl新鲜培养液。将Ad-CMV-hTrail及Ad-Egr-hTrail按MOI=100分别感染U251脑胶质瘤细胞，无病毒感染组(对照组，单纯放疗组)加入等量的PBS液，使病毒与细胞充分接触, 置于孵箱内继续培养。病毒感染肿瘤细胞2 h后,每孔再补加50 μl新鲜培养液，继续培养。感染2 d后,倒置显微镜下观察细胞感染情况,并拍照。
1.2.5 照射条件
病毒感染2 d后给予12 Gy-X射线一次性照射，无照射组给予0 Gy-X射线假照射。SSD=100，剂量率0.684 Gy/min。
1.2.6 MTS法测定
MTS法检测细胞相对存活率。将CellTiter 96 aqueous one solution reagent 置于室温，使试剂完全解冻，备用。吸弃培养孔中的培养液，每孔内加入100 μlDMEM和20 μl的CellTiter 96 aqueous one solution reagent(同时以只含100 μlDMEM和20 μl的CellTiter 96 aqueous one solution reagent的培养孔作为调零孔)，培养箱中培养4 h，然后上酶标仪测定490nm处的吸光值(OD值)。按下式计算肿瘤细胞抑制率(每组实验重复3次)：肿瘤细胞抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100/100
1.3 统计学方法
采用SPSS 12.0统计学软件进行两独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 重组腺病毒的扩增
倒置相差显微镜观察：重组腺病毒Ad-Egr-hTrail或Ad-CMV-hTrail感染AE25 crma细胞后五日， AE25 crma细胞变圆，聚集成团，呈现明显的病理效应，表明病毒开始大量扩增，此时开始收集病毒。无病毒感染的AE25 crma细胞为多边形，呈现均匀的贴壁生长。
2.2 重组腺病毒的PCR鉴定
以病毒Ad-Egr-hTrail及Ad-CMV-hTrail DNA为模板加入引物后进行PCR反应，如期扩增出1037bp的hTrail片断，表明hTrail全长被成功插入到腺病毒基因中。
2.3 两种腺病毒重组载体及放射线对 U251细胞增殖的影响
2.3.1 Ad-Egr-hTrail对U251细胞增殖的影响 本实验结果显示，单用Ad-Egr-hTrail对U251胶质瘤细胞的抑制率仅为5.49%，与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；但Ad-Egr-hTrail与12 Gy-X射线联合作用时，抑制率为40.77%，杀伤率提高了7.43倍，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。
2.3.2 Ad-CMV-hTrail对U251细胞增殖的影响 单用Ad-CMV-hTrail对U251细胞的抑制率为24.61%，与单用放射治疗组的抑制率(29.55%)相当(P>0.05)，与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)；与12 Gy-X射线联合作用时，抑制率为45.15%，杀伤率提高了1.84倍，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。
2.3.3 两种腺病毒重组载体联合放射线对U251细胞增殖的影响 Ad-Egr-hTrail+照射组及Ad-CMV-hTrail+照射组对U251胶质瘤细胞的抑制率分别为40.77%、45.15%，二者之间比较差异无统计学意义(P>0.05)；与单次大剂量(12 Gy)的放射治疗抑制率(29.55%)相比，其放射增敏比分别为1.38、1.53倍。以上结果见表1。
表1
两种腺病毒重组载体及放射线对 U251细胞增殖的影响
组别OD值(490nm)抑制率(%)增敏比P值
空白对照组1.90±0.12---
Egr组1.80±0.085.49->0.05*
CMV组1.43±0.0724.61-<0 ......
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