TRAIL联合顺铂诱导骨肉瘤HOS-8603细胞凋亡研究(1)
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【摘要】 目的 研究TRAIL联合顺铂诱导HOS-8603细胞的凋亡及其机制。方法 MTT法分别测定TRAIL，顺铂，和TRAIL+顺铂对HOS-8603细胞的抑制率，流式细胞法测定亚G1期细胞百分率及PI和Rh123双染色后细胞的ΔΨm。 结果 三组分别由TRAIL、顺铂、TRAIL+顺铂处理过的HOS-8603细胞用MTT法测抑制率分别为29%、33.6%、58.5%。 随着药物作用时间增加, HOS-8603细胞凋亡数增加和ΔΨm 降低(P<0.01), 两者呈直线相关。结论 TRAIL和顺铂能协同诱导HOS-8603细胞凋亡，其机制可能是通过使线粒体膜通透性转运孔开放, ΔΨm降低来实现的。
【关键词】TRAIL； 顺铂；细胞凋亡
骨肉瘤是一种相对耐药的肿瘤,单药化疗的效果一直不很理想。联合化疗多以铂类药物为主。TRAIL是INF超家族成员，能选择性杀伤肿瘤细胞。本实验旨在探讨TRAIL与铂类药物联合化疗方案的可行性，为骨肉瘤的临床治疗提供参考。
1 资料与方法
1.1 实验材料 HOS-8603细胞株购自中国医学科学院药物研究所; TRAIL、顺铂、CsA均购自Sigma公司(化学纯标准品)。主要器材：流式细胞仪 型号:EPICS ALTRAⅡ. American Beckman; 荧光酶标仪 型号:GENIOS VA200,AUSTRIA TECAN。
1.2 药物配制 将TRAIL用生理盐水溶解并分别配制成10ug/ml和50ug/ml两种浓度的储藏液。将顺铂、CsA分别用生理盐配制成10ug/ml的储藏液,备用。
1.3 凋亡细胞荧光染色 HOS-8603 细胞以1×106接种于六孔板培养, 加入不同浓度的TRAIL+顺铂, 培养24 h后, 经DHanks液洗涤及荧光染料Hoechst33258和PI，37℃避光染色10 min，洗涤后在荧光显微镜下观察细胞形态及颜色改变。
1.4 透射电镜观察 1000 r/min,离心10 min收集处理后的HOS-8603细胞, 经固定、脱水、包被及乙酸双氧铀和枸橼酸铅双染色处理后透射电镜观察细胞形态。
1.5 MTT法测定TRAIL，顺铂，TRAIL+顺铂对HOS-8603细胞生长的影响 取对数生长期HOS-8603细胞, 以2×106/ml 的细胞浓度, 接种于上述三种药物处理培养基中, 以生理盐水为空白对照组。将每种药物组分两组, 其中一组在加药物前30 min 加入终浓度1.0 μg/mlCsA[10,11], 每组设3 个平行对照孔。
1.6 细胞DNA含量分布测定 取药物处理12，24, 36, 48 h后HOS-8603细胞, 经固定、染色后流式细胞仪测定DNA。
1.7 细胞ΔΨm检测 参照文献[1,2], 取上述三种药物处理12, 24, 36, 48 h 后的HOS-8603细胞, 经DHanks液洗涤后用10ug/ml Rh123在37℃避光染色30 min, 再次洗涤后用10ug/ml PI在37℃避光染色20 min, 流式细胞仪检测。
1.8 统计学方法 用SPSS 统计软件包作方差分析对各组作显著性检验，TRAIL 组与TRAIL加CsA组采用配对t检验，以P<0.05具有统计学意义。
2 结果
2.1 HOS-8603细胞分别经2.5 ug/ml TRAIL，1.0 ug/ml顺铂，2.5 μg/ml TRAIL+1.0 μg/ml顺铂作用后, 都出现了明显的凋亡峰，亚G1期细胞百分率分别为29.3%，57%，83%。联合用药组明显高于单一用药组(P<0.01)。
2.2 在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散均匀荧光，出现凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密颗粒块状荧光。如图1示。
比较两图中的同一细胞高蓝/低红为凋亡细胞；低蓝/高红为坏死细胞；低蓝/低红为正常细胞。
2.3 HOS-8603细胞经2.5ug/ml TRAIL+1.0 ug/ml顺铂作用12 h后, 倒置显微镜下见细胞体积缩小，开始呈圆形，以细胞表面起泡，变成不规则形状。紧邻细胞之间出现空虚，有离群，脱落感。透射电镜下见凋亡细胞核内染色质的浓缩，形成染色质块，并集聚在核的边缘，呈半月形，花瓣状基底部紧贴核膜。胞质凝缩，最后核断裂，细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体，其外有完整的膜封闭，其内有结构完整的细胞器，还有凝缩的染色体；线粒体肿胀，空泡状，外膜破裂，内膜胀大呈气球状，脊消失。如图3所示。
图2A 染色质浓缩，形成染色质块，并边聚在核的边缘，呈半月形，花瓣状，基底部紧贴核膜。
图2B 线粒体肿胀，空泡化，内膜肿大呈气球状，脊消失。胞质间可见早期凋亡小体。
2.4 经TRAIL+顺铂和TRAIL+顺铂+CsA处理后的细胞ΔΨm 变化如表2 所示; TRAIL+顺铂组的Rh123- PI- 细胞百分率均明显高于空白对照组(P<0.01)。 表明在胞膜完整的情况下, TRAIL+顺铂能引起ΔΨm下降(P<0.01); TRAIL+顺铂作用前加入CsA后,Rh123- PI- 细胞百分率明显降低(P<0.01), 但仍高于空白对照组(P<0.01)。
2.5 TRAIL+顺铂作用于HOS-8603细胞后Rh123- PI-与亚G1 期细胞百分率间有直线相关关系(r=0.998, P<0.01), 即凋亡细胞百分率越高, ΔΨm下降细胞百分率越高。
3 讨论
联合化疗是目前提高骨肉瘤细胞对化疗的敏感性的研究热点。本研究中TRAIL+顺铂的MTT法测定抑制率为58.5%。明显优于两者单用(P<0.01)，说明在骨肉瘤化疗中顺铂和TRAIL有协同作用，能增强骨肉瘤对化疗的敏感性，并且顺铂的使用剂量明显减少。
亚G1期细胞出现是细胞凋亡的标志之一。本研究中我们采用了TRAIL、顺铂, TRAIL+顺铂分别作用于HOS-8603细胞后测定亚G1 期细胞百分率, 结果显示TRAIL+顺铂组诱导细胞凋亡的作用显著高于TRAIL组和顺铂组(P<0 ......
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