Neuregulin-1β对大鼠缺血再灌注后GAP-43表达及神经功能的影响(2)
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1.4 神经功能缺失体征评分 大鼠建立MACO/R模型,麻醉清醒后1 h,参考Zea Longa[6]法进行神经功能损伤评分,观察大鼠行为和神经功能状况。排除手术时间超过45 min、术中出血较多,术后苏醒超过1 h大鼠。神经功能评分:0分:无神经功能缺损症状;1分:轻度局灶性神经功能缺损,即提尾悬空时,左侧前肢内收、屈曲,不能伸展;2分:中度神经功能缺损,为自主运动时身体向左侧划圈 ; 3分:中神经功能缺损,即行走困难,身体向左侧倾倒; 4分为不能自主行走并伴有意识障碍。1~4分为有效模型。0分者予以剔除。
1.5 斜板实验 鼠随意运动功能,将大鼠头向下倒置于45°斜面上,用秒表记录大鼠转为头向上转>135°的时间,以秒为单位,测量三次取平均值进行比较。
1.6 GAP-43 mRNA检测
1.6.1 RT-PCR取材 严格无菌操作,由专人负责断头处死大鼠,专人取右侧大脑半暗带皮质组织100 g,迅速将组织置于4℃DEPC水中洗去血液后,放入消毒冻存管内,投入液氮壶中,然后放入-80℃低温冰箱保存备用。
1.6.2 RT-PCR测定GAP-43 mRNA表达水平 ①总RNA提取和cDNA合成:用Trizol 试剂(Invitrogen公司)提取细胞总RNA。应用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)进行RT反应,体系20 μl,各样品RNA 2 μg,oligo(dt)18引物1ul,65℃孵化5 min,冰浴5 min,42℃水浴60 min,70℃水浴5 min。-20℃低温保存;②PCR扩增GAP-43 mRNA:取2 μl获取的cDNA作为PCR反应模板进行PCR反应;使用扩增仪进行cDNA扩增,Invitrogen公司合成引物,引物序列为上游引物:5'-AAGAAGGCAGGGGAAGATAC3 ',下游引物:5 '-GGACGGCGAGTTATCAGTGG-3 ' ......
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