口腔癌患者血清核磁共振代谢组学研究(1)
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[摘要] 目的 应用核磁共振代谢组学方法研究口腔癌患者血清代谢组的特征及其变化。 方法 健康人血清(健康组，10例)和口腔癌患者血清(口腔癌组，10例)样本，采用BRUKER 500 MHz 超导核磁共振波谱仪进行检测，运用PCA分析方法，研究口腔癌患者血清代谢组的特征，探讨相关生化过程的改变。 结果 健康组与口腔癌组患者血清代谢谱有不同的代谢特征。口腔癌患者血清中氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸)，谷氨酸、糖蛋白、甲胺和二甲胺、葡萄糖的含量是升高的，而乳酸和胆碱的含量降低。 结论 根据血清代谢物的变化可以区分健康人和口腔癌患者。这种基于核磁共振氢谱的代谢组学方法可为口腔癌的诊断提供可靠代谢依据。
[关键词] 口腔癌；代谢组学；核磁共振
[中图分类号] R658 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2013)02(c)-0020-02
口腔癌是一类发生于唇、腭、舌、口底和牙龈等部位的上皮源性恶性肿瘤。目前口腔癌多采用以手术为主的治疗方法，但术后患者5年生存率只有50%左右，同时还具有较高的复发风险[1]。核磁共振1H谱(nuclear magnetic resonance 1H，NMR 1H)是研究生物样品代谢变化的一种常用手段，近年来基于核磁共振的代谢组学方法已经得到广泛应用[2-6]。本文应用核磁共振1H谱并结合多变量分析方法研究口腔癌患者血清的代谢组特征，寻找与癌变相关的血清代谢标志物，阐明口腔癌患者血清生化过程的改变。
1 材料与方法
1.1 样品收集
于广东药学院附属第一医院收集口腔癌患者血清样本10例和健康人血清10例(收集时间：2011年11月～2012年4月)，置-80℃超低温冰箱贮存。
1.2 样品预处理
采样前，将所有血清样本解冻，在4℃下，10 000 g离心10 min。取400 μL上层血清加至5 mm NMR测试管中，后加入100 μL 0.2 mol/L磷酸缓冲溶液(0.2 mol/L Na2 HPO4-0.2 mol/L NaH2PO4，pH=7.4)和50 μL重水，振荡混匀。
1.3 NMR实验
每一个样品均采集 Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG，relaxation delay-90-(τ-180-τ)n-acquisition)氢谱，总回波时间为100 ms，3 s延迟时间，64k数据点，采集次数为128。化学位移定标为乳酸甲基双重峰δ1.33。
1.4 数据预处理
采用软件TOPSPIN 2.0对所有1H CPMG谱进行自动积分，积分区间δ0.5～4.6，积分间隔0.01。主成分分析前对每一个谱的积分值进行归一化处理，后将归一化值导入软件Simca-P 12.0(Umetrics，Sweden)中进行主成分分析。
1.5 统计学方法
采用SPSS(Version 13.0，SPSS Inc.，USA)软件对正常人和口腔癌患者血清代谢物的归一化积分值做独立样本t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 健康人与口腔癌患者血清CPMG 1H谱比较
由图1可清楚地观察到亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、乳酸、丙氨酸、糖蛋白、谷氨酸、乙酰乙酸、谷氨酰胺、甲胺、二甲胺、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、胆碱和葡萄糖等信号峰。对比健康人与口腔癌病人血清CPMG 1H 谱，可以发现胆碱、葡萄糖和乳酸有明显的变化[7]。为了能够筛选出具有显著性差异的代谢标志物，将利用主成分分析和统计分析对两组样本的血清代谢组数据进行分析。图1为代表性的健康人与口腔癌患者CPMG 1H谱。
2.2 多变量分析
为了筛选出口腔癌患者血清代谢标志物，本文采用代谢组学常用的多变量分析-主成分分析方法对上述得到的CPMG 1H的归一化积分数据进行分析。主成分分析方法能够根据样本代谢图谱的特征给出样本间的分类，同时还可以筛选出对区分有较大贡献的代谢物(即化学位移区间)。对健康者(○)和口腔癌患者(●)血清CPMG 1H谱的主成分分析结果见图2(PC1 比 PC2，R2=82.5%)。可以得到口腔癌患者血清中氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸)，谷氨酸、糖蛋白、甲胺和二甲胺、葡萄糖的含量是升高的，而乳酸和胆碱的含量降低。
3 讨论
通过得分图(图2a)可以看到，健康人和口腔癌患者血清样本在PC2维可以完全区分开，通过对PC2值进行统计分析，结果表明这两类样本在PC2维具有显著性差异(P < 0.01)。负载图(图2b)给出了两类样本中主要的代谢物变化，口腔癌患者血清中氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸)，谷氨酸、糖蛋白、甲胺和二甲胺、葡萄糖的含量是升高的，而乳酸和胆碱的含量降低。进一步通过统计分析发现这些代谢物均具有显著性差异(P < 0 ......
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