人血清中牛磺酸的HPLC-荧光法测定方法学研究(2)
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2.4方法的专属性
在本实验条件下，空白血清中存在一定量的内源性牛磺酸，血清中其他内源性物质不干扰牛磺酸和内标的测定。牛磺酸的出峰时间在8.2 min左右，内标出峰时间在10.7 min左右(图1)。
图1 血清中牛磺酸典型HPLC-荧光色谱图
A：空白血清；B：牛磺酸(60 μg/ml)+内标(阿德福韦，40 μg/ml)；
C：血清+牛磺酸(60 μg/ml)+内标(阿德福韦，40 μg/ml)
1：牛磺酸(tR=8.2 min)；2：内标(阿德福韦，tR=10.7 min)
2.5标准曲线的制备
取适量牛磺酸标准溶液，氮气吹干，加入100 μl空白血清配制成血清中含待测物牛磺酸浓度分别为：1.875，3.750，7.500，15.000，30.000，60.000，120.000 μg/ml(同时做空白对照)，按“2.3”项下操作，进样分析。以待测物浓度(Y，μg/ml)为纵坐标，待测物峰面积减去空白本底药物峰面积(As)与内标峰面积(Ai)的比值(X)为横坐标，用最小二乘法[6](加权系数为W=1/X2)进行线性回归，回归方程：Y=10.599X+0.357(r=0.999 9)。
牛磺酸在1.875~120.000 μg/ml范围内线性良好，定量下限为1.875 μg/ml。
2.6精密度
取适量牛磺酸标准溶液，氮气吹干，加入100 μl空白血清配制成含待测物牛磺酸浓度分别为3.750，15.000和60.000 μg/ml的血清样品，按“2.3”项下自“精密加入10 μl内标溶液”起操作，每一浓度进行五样本分析，连续测定3 d，根据当日的平均标准曲线，计算QC样品的测得浓度。计算日内和日间的相对标准差(RSD)。3 d内，低、中、高3个浓度的日内和日间精密度均小于15%。
2.7提取回收率
按“2.6”项下，配制成血浆中含待测物牛磺酸浓度分别为3.750，15.000和60.000 μg/ml的血浆样品各3份(同时做空白对照)，按“2.3”项下自“精密加入10 μl内标溶液”起操作，得到牛磺酸药物峰面积As(H)、内标峰面积Ai及空白牛磺酸峰面积As1；
另取牛磺酸标准溶液10 μl，内标(阿德福韦)溶液(400 μg/ml)10 μl，加入80 μl甲醇，配制成低、中、高三个浓度(3.750，15.000和60.000 μg/ml)的溶液，再加入150 μl乙腈，混匀后取50 μl，加入50 μl荧光胺(2 mmol/L)，混匀后进样分析，每一浓度进行三样本分析，得到牛磺酸药物峰面积As(D)及内标峰面积Ai(D)，取其平均值。按下式计算提取回收率(%)=[(As(H)-As1)/Ai(H)]/[As(D)/Ai(D)]平均×100%。
低、中、高3种浓度的提取回收率分别为88.9%、96.0%和98.7%，RSD分别为2.24%、2.59%、1.94%。
2.8稳定性
按“2.6”项下，配制成血浆中含待测物牛磺酸浓度分别为3.750，15.000和60.000 μg/ml的血清样品共5份(同时做空白对照)，每份进行三样本分析，三份按“2.3”项下操作，分别考察室温下放置0、4和12 h后血清样品的稳定性；一份放于-20℃冰箱内，反复冻融3次，考察血清样品在冻融条件下的稳定性；一份放于-20℃冰箱内冷冻46 d后，考察血清样品在长期冷冻条件下的稳定性。结果表明，血清样品在室温、反复冻融及长期冷冻条件下稳定性均较好，RSD<15%。
3讨论
牛磺酸是一种β氨基酸，相对分子量为125，为无色、四面针状结晶，易溶于水。以游离的形式普遍存在于人体的各种组织中，属于非蛋白质氨基酸。人体含牛磺酸总量12~18 g，其中15~66 mg存在于血浆中[7]。因此，进行牛磺酸药代动力学研究时，应扣除本底效应，必要时需考察时间变化对牛磺酸浓度的影响。
由于牛磺酸相对分子量小且没有紫外吸收，2005年版《中国药典》对牛磺酸原料及制剂的含量测定采用的是柱前衍生反应，目前所使用的衍生化试剂有多种，本文使用的是荧光胺(4-苯基螺环-呋喃-2-(3H)-1′-酞烷-3，3′-二酮，Fluorescamine)，其本身无荧光，水解产物亦无荧光，但能在温和条件下与伯胺反应得到强荧光产物，且仲胺不发生类似反应。因而是一种性能优良的伯胺荧光衍生试剂，并广泛应用于脂肪胺、芳胺、多胺、氨基酸等伯胺，以及经化学转化能生成伯胺或芳伯胺化合物的荧光测定和某些化合物的间接测定[8]。
本实验条件下，牛磺酸被荧光胺衍生化后，衍生产物稳定，采用HPLC-荧光法测定(激发波长275 nm、发射波长420 nm)，每个样品分析时间约10 min，扣除血清中内源性牛磺酸的影响，牛磺酸的线性范围为1.875～120.000 μg/ml，日内、日间精密度均小于15%，低、中、高浓度的(3.750、15.000、60.000 μg/ml)平均提取回收率分别为88.9%、96.0%和98.7%。该方法符合生物样品的检测要求。操作快速、简单、准确，适用于临床药代动力学研究中大批量生物制品的处理。
[参考文献] ......
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