反义RNA在细菌、病毒研究中的进展(1)
[摘要] 反义RNA(asRNA)不仅可以调节真核生物基因表达，而且在细菌和病毒中也有沉默基因作用。耐药细菌不断增加，而发现具备新作用机制的抗生素已经非常困难，asRNA可以增敏细菌对潜在抗生素的作用，在发现新抗生素方面有应用价值。目前缺乏对人类1型免疫缺陷病毒(HIV-1)和人类乳头瘤病毒16型(HPV-16)感染的有效治疗措施，asRNA对这两种病毒有多个作用靶点，有希望发展成治疗病毒感染的有效药物。
[关键词] asRNA；增敏；抗生素；HIV-1；HPV-16
[中图分类号] R34[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2008)06(a)-031-03
Advances of antisense RNA for bacteria and viruses
WANG Xiao-yan, WANG Xiu-fang, LU Zhan-jun*
, http://www.100md.com
(Department of Laboratory Animal Science, Genetics Staff Room, Hebei Medical University, Shijiazhuang050017, China)
[Abstract] Antisense RNA(asRNA) silence gene in eukaryotic cells and in microorganism. Examples of drug-resistant bacteria are increasing while the discovery of new antibiotics with new mechanisms of action has been essentially nonexistent. asRNAs are being applied in the discovery of new antibiotics since they enhance the sensitization of bacteria to potential antibiotics. Effective measures for treating patients with infections of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human papillomavirus type 16 (HPV-16) are absent. Both HIV-1 and HPV-16 have various effective targets for asRNAs that may develop new therapeutic drugs for curing infection of the viruses.
, 百拇医药
[Key words] asRNA; Enhancing sensitization; Antibiotics; HIV-1; HPV-16
反义RNA通过影响转录，转录后和翻译调节基因表达。尽管asRNA沉默基因机制与RNA干涉(RNAi)有类似之处，但是两者并不完全相同。HelF为一种RNA螺旋酶，属于RNAi的核抑制剂，在缺失HelF的细胞中，RNAi作用增加，asRNA沉默基因作用不变[1]。反义核酸技术包括asRNA，asDNA，修饰的RNA等，其中asRNA在细胞自然状态下可以发生，参与正常生理调节[2，3]。asRNA在细菌和病毒研究方面有一定的应用价值。
1 asRNA技术在新抗生素发现中的应用
耐药细菌不断增加，而发现具备新的作用机制的抗生素已经非常困难。为了治疗耐药菌感染以满足临床需求，使用新的方法寻找抗生素是当务之急。虽已证明在细菌中存在数百种蛋白质可以做为潜在的抗生素靶向分子，但是目前只发展出针对这些蛋白质中少数的治疗药物。以反义核酸为基础的靶向作用可以增敏葡萄球菌，为特异性靶向抗生素的发现提供了高敏感性方法[4]。脂肪酸生物合成途径中的缩合酶(FabH/FabF)是细菌代谢所必需的，缺乏缩合酶(FabH/FabF)的细菌不能生长。将待检放线菌产物接种携带FabH/FabF asRNA质粒的细菌平板，同时接种不携带该种质粒的细菌平板，观察抑菌圈的差异，可以迅速高通量筛选靶向FabH/FabF的抗生素[5]。
, 百拇医药
为了改善asRNA表达引起基因沉默的效果，在大肠埃希菌中，用不同基因做靶，系统改变了asRNA的若干参数，发现侧翼反向重复产生配对双链RNA末端(PT)结构效果良好。靶向醋酸激酶-磷酸转乙酰酶基因操纵子(ackA-pta)的 PTasRNA引起ackA mRNA降解，ackA 活性降低78%。PT结构对于改善asRNA沉默脂烯酰基酰基载体蛋白还原酶(fabI)基因也有效，fabI PTasRNA能够抑制敏感细胞生长[6]。
2asRNA下调细菌基因表达
2.1 细菌生理
asRNA参与细菌的生理调节，包括转录终止、生物合成等。在大肠埃希菌基因组中的非编码RNA(ncRNA)基因可以通过一种新的数学模型索引(Gapped Markov Model Index，GMMI)识别。运用大肠埃希菌基因组中sigma70 启动子和rho-终止子的参照序列获得可能的转录单位，用GMMI评价，得到133个ncRNA候选基因，其中包含29个先前已经注释的小RNA基因和46个可能的反义ncRNA，12个基因的转录物(包括5个asRNA)已经通过表达分析证实。这些数据提示在大肠埃希菌中asRNA的表达可能比以往认识的要多[7]。
, 百拇医药
铁转运生物合成基因簇(ITB)操纵子在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)含四个铁转运基因(fatD,-C,-B,和-A)和两个铁生物合成基因(angR和angT)，ITB在该细菌毒力机制中起重要作用。fat部分的转录水平是全长基因转录水平的17倍，这种差异基因表达是由于只有少数转录物到达基因末端，大部分转录物在fatA 和angR基因之间终止，该过程可能需要一个427nt长的asRNA结合在基因间序列作为一种新的转录终止因子发挥作用[3]。
抑制纤维体中主要纤维素酶(Cel48F)合成可以改变解纤维素梭菌(Clostridium cellulolyticum)产生的纤维素酶组成。ATCC35319菌株(pSOSasrF)过量产生496nt长度的asRNA，该asRNA针对cel48F mRNAs核糖体结合位点和编码起始区域，使纤维素分解活性减少30%[8]。
2.2 实验研究
使菌体中针对特定基因的asRNA水平上升，导致基因表达减弱，是否影响细菌的生理功能与所针对的基因有关。先前的工作证明一组α/β型小分子，酸溶性的芽孢蛋白(SASP)与产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)的芽孢与湿热抵抗性有关。这个结论是以缺失三个SASP 蛋白质基因中一种的C型产气荚膜梭状芽孢杆菌芽孢为依据作出的。使用asRNA降低C型产气荚膜梭状芽孢杆菌SASP水平达90%，这些芽孢明显地降低了对湿热和紫外线的抵抗性，但对干热的抵抗不降低，这些结果与用缺失实验所得结论一致[9]。, 百拇医药(王晓燕 王秀芳 吕占军)
[关键词] asRNA；增敏；抗生素；HIV-1；HPV-16
[中图分类号] R34[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2008)06(a)-031-03
Advances of antisense RNA for bacteria and viruses
WANG Xiao-yan, WANG Xiu-fang, LU Zhan-jun*
, http://www.100md.com
(Department of Laboratory Animal Science, Genetics Staff Room, Hebei Medical University, Shijiazhuang050017, China)
[Abstract] Antisense RNA(asRNA) silence gene in eukaryotic cells and in microorganism. Examples of drug-resistant bacteria are increasing while the discovery of new antibiotics with new mechanisms of action has been essentially nonexistent. asRNAs are being applied in the discovery of new antibiotics since they enhance the sensitization of bacteria to potential antibiotics. Effective measures for treating patients with infections of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human papillomavirus type 16 (HPV-16) are absent. Both HIV-1 and HPV-16 have various effective targets for asRNAs that may develop new therapeutic drugs for curing infection of the viruses.
, 百拇医药
[Key words] asRNA; Enhancing sensitization; Antibiotics; HIV-1; HPV-16
反义RNA通过影响转录，转录后和翻译调节基因表达。尽管asRNA沉默基因机制与RNA干涉(RNAi)有类似之处，但是两者并不完全相同。HelF为一种RNA螺旋酶，属于RNAi的核抑制剂，在缺失HelF的细胞中，RNAi作用增加，asRNA沉默基因作用不变[1]。反义核酸技术包括asRNA，asDNA，修饰的RNA等，其中asRNA在细胞自然状态下可以发生，参与正常生理调节[2，3]。asRNA在细菌和病毒研究方面有一定的应用价值。
1 asRNA技术在新抗生素发现中的应用
耐药细菌不断增加，而发现具备新的作用机制的抗生素已经非常困难。为了治疗耐药菌感染以满足临床需求，使用新的方法寻找抗生素是当务之急。虽已证明在细菌中存在数百种蛋白质可以做为潜在的抗生素靶向分子，但是目前只发展出针对这些蛋白质中少数的治疗药物。以反义核酸为基础的靶向作用可以增敏葡萄球菌，为特异性靶向抗生素的发现提供了高敏感性方法[4]。脂肪酸生物合成途径中的缩合酶(FabH/FabF)是细菌代谢所必需的，缺乏缩合酶(FabH/FabF)的细菌不能生长。将待检放线菌产物接种携带FabH/FabF asRNA质粒的细菌平板，同时接种不携带该种质粒的细菌平板，观察抑菌圈的差异，可以迅速高通量筛选靶向FabH/FabF的抗生素[5]。
, 百拇医药
为了改善asRNA表达引起基因沉默的效果，在大肠埃希菌中，用不同基因做靶，系统改变了asRNA的若干参数，发现侧翼反向重复产生配对双链RNA末端(PT)结构效果良好。靶向醋酸激酶-磷酸转乙酰酶基因操纵子(ackA-pta)的 PTasRNA引起ackA mRNA降解，ackA 活性降低78%。PT结构对于改善asRNA沉默脂烯酰基酰基载体蛋白还原酶(fabI)基因也有效，fabI PTasRNA能够抑制敏感细胞生长[6]。
2asRNA下调细菌基因表达
2.1 细菌生理
asRNA参与细菌的生理调节，包括转录终止、生物合成等。在大肠埃希菌基因组中的非编码RNA(ncRNA)基因可以通过一种新的数学模型索引(Gapped Markov Model Index，GMMI)识别。运用大肠埃希菌基因组中sigma70 启动子和rho-终止子的参照序列获得可能的转录单位，用GMMI评价，得到133个ncRNA候选基因，其中包含29个先前已经注释的小RNA基因和46个可能的反义ncRNA，12个基因的转录物(包括5个asRNA)已经通过表达分析证实。这些数据提示在大肠埃希菌中asRNA的表达可能比以往认识的要多[7]。
, 百拇医药
铁转运生物合成基因簇(ITB)操纵子在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)含四个铁转运基因(fatD,-C,-B,和-A)和两个铁生物合成基因(angR和angT)，ITB在该细菌毒力机制中起重要作用。fat部分的转录水平是全长基因转录水平的17倍，这种差异基因表达是由于只有少数转录物到达基因末端，大部分转录物在fatA 和angR基因之间终止，该过程可能需要一个427nt长的asRNA结合在基因间序列作为一种新的转录终止因子发挥作用[3]。
抑制纤维体中主要纤维素酶(Cel48F)合成可以改变解纤维素梭菌(Clostridium cellulolyticum)产生的纤维素酶组成。ATCC35319菌株(pSOSasrF)过量产生496nt长度的asRNA，该asRNA针对cel48F mRNAs核糖体结合位点和编码起始区域，使纤维素分解活性减少30%[8]。
2.2 实验研究
使菌体中针对特定基因的asRNA水平上升，导致基因表达减弱，是否影响细菌的生理功能与所针对的基因有关。先前的工作证明一组α/β型小分子，酸溶性的芽孢蛋白(SASP)与产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)的芽孢与湿热抵抗性有关。这个结论是以缺失三个SASP 蛋白质基因中一种的C型产气荚膜梭状芽孢杆菌芽孢为依据作出的。使用asRNA降低C型产气荚膜梭状芽孢杆菌SASP水平达90%，这些芽孢明显地降低了对湿热和紫外线的抵抗性，但对干热的抵抗不降低，这些结果与用缺失实验所得结论一致[9]。, 百拇医药(王晓燕 王秀芳 吕占军)