啮齿类小鼠γ-干扰素原核表达、纯化及功能鉴定(2)
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1.2.3 pET30a(+)/mIFN-γ原核表达载体的构建与鉴定PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，凝胶回收试剂盒纯化回收。质粒小提试剂盒小提质粒pET30a(+)；质粒pET30a(+)经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，凝胶回收试剂盒纯化回收。T4 DNA连接酶连接纯化的PCR产物和pET30a(+)，将连接产物转化至感受态大肠杆菌JM109，卡那霉素抗性筛选，PCR及酶切鉴定阳性重组质粒pET30a(+)/mIFN-γ。将pET30(+)/mIFN-γ转化至感受态大肠杆菌BL21，从转化平板上随机挑取单菌落，在3 ml LB中37℃震荡培养12~16 h，菌液-80℃冻存。
1.2.4 His6-mIFN-γ蛋白的融合表达取冻存菌接种于4~5 ml的LB(卡那霉素50 ng/ml)，37℃培养过夜，按1∶50转接于LB(含卡那霉素50 ng/ml)中，37℃培养至OD值为0.6~0.8，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG 37℃震荡培养3 h，并设IPTG未诱导对照组。离心收集1.5 ml菌液，进行SDS-PAGE表达分析。
1.2.5 工程菌裂解后融合蛋白的可溶性鉴定取蛋白表达阳性的冻存菌种于4~5 ml的LB(卡那霉素50 ng/ml)，37℃ 培养过夜，按1∶50转接于LB(含卡那霉素50 ng/ml)中，37℃培养至OD值为0.6~0.8，加入终浓度为0.5 mmol/L 的IPTG 25℃震荡培养7 h，离心收集1.5 ml菌液，冰上适量溶菌酶裂解缓冲液裂解菌体，超声裂菌(输出频率为25 Hz，4℃，30 s×10)。4℃,15 000 r/min离心15 min ......
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