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编号:11719624
大鼠真皮间充质干细胞的分离培养
http://www.100md.com 2008年12月1日 《现代医药卫生》 2008年第23期
大鼠真皮间充质干细胞的分离培养
大鼠真皮间充质干细胞的分离培养

     【摘要】目的:建立大鼠真皮间充质干细胞的分离培养扩增的方法。方法:用0.25%的胰蛋白酶消化分离表皮与真皮,然后0.1%I型胶原酶消化获得单细胞悬液,离心后去上清加入适量L-DMEM完全培养基,放入24孔板,置37 ℃,5% CO2培养箱培养。结果:培养3天后出现少量贴壁细胞,呈长梭形,10天后基本长满单层。细胞传代后增殖速度明显加快。结论:用酶消化法能分离得到真皮间充质干细胞。

    【关键词】真皮;间充质干细胞;大鼠;培养

    文章编号:1009-5519(2008)23-3488-03 中图分类号:R37 文献标识码:A

    皮肤是脊椎动物身体上最大的器官,它具有许多功能,包括体温调节,传导触觉,保护身体免受外界的侵袭和伤害。皮肤主要有两层,表皮和真皮。表皮是由角化细胞组成的多层鳞状上皮,真皮由乳突层和网状层两层[1]。真皮不能再生,缺损后由纤维组织来修复,这就会失去皮肤的许多功能,影响个体生活质量。皮肤组织工程的研究为此类患者的治疗提供了希望。皮肤组织工程有3个重要的因素:种子细胞,支架材料,以及两者的结合。国内外已经有不少学者对皮肤组织工程的种子细胞进行了研究。研究较多的主要为表皮干细胞和骨髓间充质干细胞。自2000年,加拿大研究者Toma等[2]从幼年及成年大鼠皮肤中分离出真皮干细胞,这种细胞分裂增殖能力强,具有多分化潜能,是一种新发现的来源于真皮的多能干细胞,就掀起了对DMSCs的研究热潮。近来,国内外学者对DMSCs分离、纯化、体外扩增和冻存的研究进行了不断的探索。本研究应用酶消化法,从大鼠真皮中分离出DMSCs并进行纯化增殖,以及观察真皮间充质干细胞(DMSCs)的生长情况,并对DMSC的冻存条件进行研究,为进一步的实验研究打下基础。

    1 材料与方法

    1.1 主要试剂及仪器:SD大鼠购自浙江省实验动物中心,L-DMEM 为Gibco产品,胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司),胰蛋白酶为Sigma产品,二甲基亚砜(DMSO)由江苏鸿声化工厂生产的分析纯,24孔塑料培养板为Falcon产品,25 cm2、75 cm2塑料培养瓶为Orange产品。

    1.2 大鼠DMSCs提取:(1)取出生1天内的SD大鼠幼鼠1只,引颈处死后,浸入事先配好的75%酒精中消毒3分钟;(2)将幼鼠从酒精中取出,放入大平皿中,用眼科剪和镊子将幼鼠背部皮肤小心剪下,用PBS漂洗,剔除脂肪组织后,将整块皮片面朝下放入预先加了适量0.25%胰蛋白酶的小平皿中,浸没为宜,放37 ℃培养箱,消化4 h。(3)4h后取出平皿,将皮片取出放入干的平皿中,小心将表皮与真皮剥离。(4)将真皮剪成碎末状,加入0.1%I型胶原酶适量,4℃消化过夜。(5)将消化好的组织加入L-DMEM培养基后离心1000 r/m×5 min,弃上清,加适量的培养基混匀后吸入24孔培养板,每孔2 ml,置37 ℃,5% CO2培养箱培养24小时后换液,以后每周换液2次。3天后出现细胞克隆,10天后,细胞基本长满单层,用0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化约4 min,得到原代DMSCs悬液,再以1×104 cells/cm2传代培养。传代细胞以75 cm2、25 cm2塑料培养瓶培养。并按此方法反复传代增殖,每日用倒置显微镜观察。换液过程中弃除悬浮生长的杂细胞,传代时严格控制酶的量和消化时间。

    1.3 大鼠DMSCs的生长曲线测定:取生长良好的第二、四、八代DMSCs,用0.25%的胰蛋白酶消化,均以1×104 cells/m1接种于24孔板,每天各取2孔消化计数,每孔计数3次,计算均值,连续10d。以培养时间为横轴(t/d),细胞数为纵轴,绘制生长曲线。

    1.4 大鼠DMSCs的冻存及复苏:将生长旺盛并已基本长满瓶底的第三代细胞消化,用1 ml的L-DMEM完全培养基 (含10%牛血清)将细胞冲洗下来,加入1 ml二甲基亚砜(DMSO)与牛血清(FBS)的混合液(DMSO∶FBS为1∶3),混匀后加入冻存管中,细胞的终浓度为2×106 cells/ml,放入厚壁塑料泡沫盒中,密封,置-60℃冰箱过夜,再放入液氮罐保存。6个月后,将冻存管从液氮罐中取出,立即放入37 ℃温水中,并轻轻摇动使其快速融化,在无菌条件下将液体移入离心管中加4 ml L-DMEM培养基混匀后离心,1000 r/min离心5 min,取出,弃上清,加入少量培养基将细胞团吹散后移入培养瓶,加适量的培养基,5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养。观察其生长增殖情况。

    2 结果

    2.1 大鼠DMSCs分离与培养:经过酶消化后的真皮组织呈现白色,将消化后的消化液及组织离心后,弃上清,加入适量培养基后吹打,把细胞悬液及组织直接接种培养24h后,观察发现孔内有大量的小圆形的细胞,3天后出现细胞克隆(见图1),10天后,细胞基本长满单层(见图2)。细胞贴壁生长,呈长梭形,细胞传代后增殖速度较原代细胞快,约5天长满培养瓶底。多次传代的DMSCs融合生长时,细胞呈成纤维细胞样(见图3),传代11代,细胞仍生长旺盛,形态无明显变化。

    2.2 大鼠DMSCs的生长曲线测定:第二、四、八代细胞生长曲线(见图4)。从生长曲线可见,大鼠DMSCs具旺盛的增殖能力,所测各代生长曲线相似,均呈“∫”形,但随着代数的增加,细胞生长有所减慢。细胞培养1d时,细胞稍有减少,为细胞的适应期。4d后细胞数迅速增加,为对数生长期。8d时达到顶点进入平台期,细胞保持动态平衡状态。

    2.3 大鼠DMSCs的冻存及复苏:大鼠DMSCs经6个月冻存后复苏培养,细胞形态及生长状况与冻存前无明显差别,均呈长梭形。液氮保存存活率为80%,细胞生长增殖旺盛。提示大鼠DMSCs可用液氮保存,且不影响细胞的活力。这对进行DMSCs研究提供了方便的细胞来源,并对择期进行DMSCs的移植有重大的意义。

    3 讨论

    目前研究者对骨髓来源的间充质干细胞研究比较多,对于真皮等其他来源的间充质干细胞的研究不多,都处于初级阶段,对于它们的分离纯化培养方法也只是初步探索。从真皮中分离多能干细胞主要有两种方法,酶消化法[3]和一种类似神经干细胞培养方法[4~7],这两种方法分离的细胞主要区别是前者主要表达间充质来源的特征,后者主要表达神经前体细胞特征。本实验利用了DMSCs具有贴壁生长的特性,采用酶消化法来分离获得真皮间充质干细胞。DMSCs原代生长是以克隆状向周边散发生长,传代后就不再出现该克隆状生长方式。DMSCs能在短时间内贴壁,生长旺盛,可在体外快速大量增殖。目前大鼠DMSCs已经传至12代,该DMSCs仍能保持旺盛的生长和增殖能力。对大鼠DMSCs的生长曲线的研究发现DMSCs大致呈“∫”形生长模式,即经历初期的适应期,然后迅速增殖,为对数增殖期,细胞长满后就进入生长平台期。所测各代DMSCs有相似的生长曲线。第三代的DMSCs经过液氮长期冻存后,复苏培养发现该DMSCs的生长增殖及形态与冻前无差异,这对择期进行DMSCs研究及移植手术具重要意义。

    对DMSCs的研究主要存在一个分离后如何纯化及鉴定的问题。目前也只有通过不断传代来达到纯化细胞的目的,也没有一个鉴定DMSCs的金标准,只能根据DMSCs本身的特点设计检测方案,检测结果符合DMSCs的特点来证实分离获得的细胞为所需的DMSCs。但DMSCs有其无法替代的优点,如取材方便,体外增殖能力强,可进行自体移植治疗,避免了免疫排斥反应等特点。虽然DMSCs研究尚处于初级阶段,随着对它的不断深入研究,DMSCs作为皮肤组织工程的种子细胞,用于皮肤损伤的治疗将成为一种新的治疗选择。

    参考文献:

    [1] Stocum,DL.Regenerative biology and medicine[M].科学出版社,2007.21.

    [2] Toma JG,Akhavan M,Fernandes KJ,et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin[J].Nat Cell Biol,2001,3:778.

    [3] 史春梦,程天民.大鼠真皮多能间充质干细胞的分离培养[J]. 第三军医大学学报,2001,23(9):1068.

    [4] 崔苏萍,李 悦,谢 安,等. 大鼠真皮多能干细胞分离培养及其多分化潜能特性[J].中华实验外科杂志,2007,24(8):1006.

    [5] 柯昌能,利天增,徐盈斌,等.老年人皮肤多能干细胞的分离及有效扩增[J].中华实验外科杂志,2005,22:1436.

    [6] Femandes K3L,McKenzie IA,Mill P,et al.A dermal niche for multi-potent adult skin-derived precursor cells[J].Nat Cell Biol,2004,6:1082.

    [7] Toma JG.Isolation of skin-derived precursors (SKPs)and differentia-tion and enrichment of their Schwann cell progeny[J].Nat Protoc,2006,1:2803.

    收稿日期:2008-07-22, 百拇医药(杨亚冬 张文元 房国坚)