大鼠舌下神经压榨损伤后磷酸化p38MAPK表达的变化(1)
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【摘要】目的：检测舌下神经压榨损伤前后磷酸化p38MAPK的表达情况，探讨运动神经损伤对p38MAPK通路的影响。方法：40只SD大鼠随机分为对照组和模型组，两组动物存活时间分别为1、3、5、7和14天。分别于各时间点取脑干用于免疫组化测定及Nissl染色。结果：舌下神经压榨损伤后，舌下神经核内磷酸化p38MAPK免疫阳性神经元数目和染色深度均明显增加，与对照组比差异有统计学意义(P<0.05)。
【关键词】p38；MAPK；舌下神经；损伤
文章编号：1009-5519(2008)21-3171-02 中图分类号：R78 文献标识码：A
p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein
kinases，MAPK)级联信号转导途径之一。p38MAPK途径可被多种应激刺激激活，磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)为p38MAPK的激活状态。目前已有大量研究证实中枢神经和感觉神经损伤后可激活p38MAPK通路[1]，但运动神经损伤后是否同样激活p38MAPK通路，目前尚不清楚。本实验建立大鼠舌下神经压榨损伤模型，检测损伤前后p-p38MAPK的表达情况，探讨运动神经损伤对p38MAPK通路的影响。
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1 材料和方法
1.1 实验动物及试剂：健康成年SD大鼠40只，雌雄各半，体重200~250 g，由中南大学湘雅医学院实验动物部提供。兔抗p-p38MAPK单克隆抗体购于美国Cell Signaling公司。
1.2 动物分组：健康SD大鼠40只，随机取20只作为正常对照组；20只建立舌下神经压榨损伤模型组。两组动物存活时间分别为1、3、5、7、和14天。分别于各时间点取材用于免疫组化测定及Nissl染色。
1.3 舌下神经压榨损伤模型制备：参照Armstong[2]和Bussmann[3]方法建立大鼠舌下神经压榨损伤模型，用10%水合氯醛腹腔麻醉后手术，在颌下区作垂直切口，于左侧二腹肌肌腱下方显露右侧舌下神经干，在左侧二腹肌肌腱下正下方，舌下神经分叉前近中2 mm处用头部宽2 mm的无齿显微血管钳钳夹神经，钳夹强度统一咬合一齿，持续时间30秒，然后把血管钳旋转90度再次钳夹30秒，确保所有大鼠左侧舌下神经仍保持连续性，压榨的力量、时间标准均保持一致，逐层缝合切口。对照组动物暴露舌下神经后即缝合切口，不做压榨。
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1.4 免疫组织化学方法：常规麻醉动物，多聚甲醛灌注，取第四脑室相对应的脑干部位，长约1 cm，在其右侧腹侧作标记。冰冻横断切片，片厚30 ?滋m，血清封闭，加入抗p-p38MAPK抗体(1∶100)，滴加生物素标记的第二抗体及辣根酶标记链霉卵白素，DAB显色，贴片，脱水，透明，封片，光镜观察，棕色染色的为阳性细胞，阴性对照实验中用PBS代替一抗或二抗，未见p-p38MAPK样染色的神经元。每只动物随机选取5张脑片，在Olympus光学显微镜计数20×10倍视野下的p-p38MAPK阳性细胞数， 每张脑片2个视野，共获10个数值，取均数作为每只大鼠的结果，并用Advance3.2图像分析系统作灰度分析。
1.5 Nissl染色：组织制备与切片同免疫组织化学法，分别取术后7天，14天模型组大鼠脑片做Nissl染色。1%甲苯胺蓝室温染色3 min，蒸馏水冲洗，酒精分色，脱水，透明，封片。每只动物随机取5张尼氏染色切片，在10×10倍光镜下观察，采用双盲法，分别计数损伤侧舌下神经核与正常侧舌下神经核内神经元数目。列入计数范围的神经元标准：胞体为锥体形或椭圆形，外形完整，核圆形，尼氏体显著的大、中型神经元。比较正常侧和损伤侧的细胞数，为便于统计和比较，通常假定正常时双侧数目大致相等，故将正常侧数目定为100，计算损伤侧的百分比，Schmalbruc等及周长满等称之为存活率[4]。
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1.6 数据处理：所有实验数据以均数±标准差(x±s)表示，通过SPSS12.0软件对组间均数进行单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 免疫组化结果：对照组舌下神经核内神经元胞体几乎不表达p-p38MAPK，模型组舌下神经压榨损伤术后损伤侧(左侧)p-p38MAPK表达增高，可见棕黄色深染免疫反应阳性运动神经元，胞核、胞浆、胞膜上棕黄或黄色颗粒，灰度值降低，正常侧(右侧)舌下神经核几乎无p-p38MAPK免疫反应阳性物表达(见图1)。模型组术后1天损伤侧(左侧)舌下神经核内神经元胞体p-p38MAPK表达即有明显升高，灰度值明显降低，可见免疫反应阳性神经元细胞，3天时p-p38MAPK表达量达高峰，灰度值达到最低，阳性细胞数达最高。5天p-p38MAPK表达量开始降低，但仍维持较高水平，此后逐渐下降，到14天p-p38MAPK表达仍高于对照组(见表1，表2)。5天、7天和14天p-p38MAPK免疫反应阳性细胞数和灰度值与上一时间段差异均有统计学意义(P<0.05)。
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2.2 Nissl染色结果：术后7天和14天，模型组损伤侧舌下神经核内运动神经元数目均较正常侧少，差异有统计学意义(P<0.05)(见图2)。提示有明显的神经元死亡现象，存活的神经元中，仍有相当一部分神经元出现退变的形态变化，如胞浆尼氏体解聚、溶解，胞体明显肿胀，核消失等现象。14天时模型组损伤侧舌下神经核内运动神经元存活率明显低于同组7天的存活率，两者差异有统计学意义(P<0.05)(见表3)。
3 讨论
近年来，各种神经损伤模型证实：p38MAPK在中枢神经及感觉神经损伤后早期被激活，在损伤区的神经细胞中表达增加，并表现出时间相关性。Wu等[5]发现，小鼠大脑缺血性损伤后10min缺血区的神经元星形胶质细胞内p38MAPK开始被激活，缺血后2h，p-p38MAPK活性达峰值，而给予p38MAPK抑制剂SB239063可明显减少梗死体积和减少神经元的缺损，证明p38MAPK参加与脑缺血损伤过程的信号传导。Wang等[6]发现大鼠脊髓损伤后p-p38MAPK表达迅速升高，损伤后6小时达到高峰，另外鞘内注射IL-1β受体拮抗剂可降低p-p38MAPK的表达，证明p38MAPK参与IL-1β介导的神经凋亡。Kim等[7]发现大鼠坐骨神经慢性缩窄性损伤后背根神经节p-p38MAPK免疫反应阳性神经元明显增加。
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本实验建立大鼠舌下神经压榨损伤模型，结果显示p-p38MAPK在模型组舌下神经核神经元胞体几乎不表达，当受压榨损伤后舌下神经核神经元胞体p-p38MAPK表达明显增高，可见神经元棕黄色深染，轮廓清楚，细胞胞浆、胞核棕黄或黄色颗粒。模型组术后1天损伤侧(左侧)舌下神经核内神经元胞体p-p38MAPK表达即有明显增高，灰度值开始降低，可见免疫反应阳性神经元细胞增多，3天时表达量即达到高峰，灰度值达到最低，阳性细胞数达最高。之后逐渐降低，至14天p-p38MAPK表达量仍高于对照组。同时尼氏染色结果显示损伤侧舌下神经核内舌下神经元数目与对侧比减少，表示存在神经元的死亡。以上结果提示：运动神经损伤的刺激亦可激活p38MAPK通路，同时激活的p38MAPK通路亦参与运动神经损伤后神经细胞的死亡过程，其激活效应在损伤早期更为明显。其机制尚不清楚，目前认为，p38MAPK至少通过以下途径参与细胞死亡：(1)增强c-myc基因表达；(2)磷酸化p53；(3)参与Fas/Fasl介导的凋亡；(4)激活c-jun 和c-fos；(5)刺激bax流入线粒体而导致神经元细胞死亡；(6)上调TNF-?琢的表达。, 百拇医药(范丽苑 涂 玲)