二十碳五烯酸对人肝胆管癌细胞株FRH-0201增殖的影响(2)
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参见附件。
1.2药物配制
EPA购自美国Sigma公司(产品号：E0441)，以无水乙醇溶解，置-70℃避光保存备用。临用前用RPMI1640培养基稀释配置成不同浓度，并将无水乙醇终浓度控制在0.1%以下。
1.3细胞培养
人肝胆管癌细胞株FRH-0201购自美国模式培养物典藏所(American Type Culture Collection, ATCC)；小鼠成纤维细胞L-929，购于中科院上海细胞生物所。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中传代培养。取对数生长期细胞，经胰酶消化后，调整细胞浓度进行实验。
1.4对FRH-0201细胞的增殖抑制率及IC50
取处于对数生长期的FRH-0201细胞，以RPMI 1640培养液制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，于37℃、5%CO2细胞培养箱内孵育24h，加入100μL不同浓度的EPA稀释液(100、50、25、12.5、6.25、0μg/mL)，每个浓度重复8孔。同时设立正常小鼠成纤维细胞L-929为对照。继续培养48h，各孔加入50μL MTT溶液(2mg/mL)，再继续培养2h。弃去各孔培养液，分别加入150μL 酸性DMSO溶液，振荡使结晶溶解，于室温暗处放置10min，以酶标仪于波长570nm测定OD值，按下列公式计算抑制率(%)。以NDST软件，Bliss法求出IC50。
细胞抑制率(%)＝(1-加药细胞OD值对照细胞OD值)×100%。
1.5对细胞生长曲线的影响
传代培养的FRH-0201细胞以不同浓度的EPA(40、30、22.5、16.875、12.656、0μg/mL)分别处理24、48、72、96h，用台盼蓝染色后计算台盼蓝拒染细胞数，由此计算出活细胞浓度并绘制药物作用细胞96 h的生长曲线图。
1.6对细胞周期的影响
FRH-0201细胞经不同浓度的EPA稀释液(70、50、32、0μg/mL)处理48h后，收集细胞，经预冷的PBS洗两次，调整浓度为1×106个/mL，预冷的70%乙醇固定，4℃避光保存24h，加100μL Rnase A 溶液，37℃水浴加热30min，再加入400μL 碘化丙啶(PI)染色液，混匀，4℃避光放置30min，BECKMAN COULTER Epics Altra型流式细胞仪检测细胞周期，记录激发波长488nm处的红色荧光。
1.7荧光染色形态学观察
对数生长期的FRH-0201细胞经不同浓度的EPA稀释液(0、24、32、60μg/mL)处理24h后，吖啶橙染液(5μg/mL)染色荧光显微镜下观察并拍照。
1.8电镜检查
不同浓度的EPA稀释液(0μg/mL、40μg/mL)处理细胞24h后，收集细胞，2.5%戊二醛溶液于4℃固定过夜，乙醇脱水，行透射电镜观察并拍照。
1.9流式细胞仪测细胞凋亡率
以不同浓度的EPA稀释液(0、32、50、70μg/mL)处理细胞48h后，收集约1~5×105个细胞，PBS洗2次，加入500μL Binding Buffer悬浮细胞；加入5μL Annexin V-FITC混匀后，加入5μL PI，混匀，室温避光染色5~15min，流式细胞仪以激发光波长488 nm进行DNA分析，所得数据用流式细胞仪自备软件分析。
2结果
2.1EPA对FRH-0201细胞株的增殖抑制作用及IC50
MTT法测定结果表明，EPA对FRH-0201细胞作用48h后，明显抑制FRH-0201细胞增殖，最高抑制率达89.92%±0.42%，IC50值为(32.20± 1.70μg/mL。见表1。EPA对正常小鼠成纤维细胞L-929无明显抑制作用，不同浓度组间及对照组OD值相比差异无显著性(P>0.05)。见表2。
表1EPA对FRH-0201细胞增殖的抑制率和IC50
DrugConc. (mg/mL)6.2512.52550100FRH-02019.45±5.1914.95±5.7231.08±7.4172.60±4.8589.92±0.42表2EPA对L-929细胞增殖的影响
Conc. (mg/mL)Control6.2512.52550100L-9290.515±0.0330.509±0.0640.517±0.1150.510±0.1340.479±0.1630.480±0.1492.2对生长曲线的影响
台盼蓝拒染细胞数法测定EPA对FRH-0201细胞生长曲线的影响。结果表明，EPA各浓度在0～96h间对FRH-0201细胞增殖均有抑制作用，并呈时间依赖性。见插页Ⅴ图1。
2.3对细胞周期的影响
流式细胞仪检测分析结果表明，FRH-0201细胞经EPA 32、50、70μg/mL处理48h后，其G0/G1期细胞百分比随着EPA浓度的增加而上升，而S期和G2/M期细胞百分比则显著下降(插页Ⅴ图2)。细胞阻滞在G0/G1期。
2.4荧光染色形态学观察
吖啶橙染色后，在荧光显微镜下观察，对照组FRH-0201细胞核DNA显黄绿色均匀荧光，EPA各处理组细胞核或细胞质内可见致密的黄绿色荧光，甚至可见浓染的黄绿色碎片，呈现典型的细胞凋亡形态学变化。见插页Ⅴ图3。
2.5电镜观察
透射电镜观察FRH-0201细胞的超微结构，发现经EPA 40μg/mL处理24h后，胞浆内形成空泡，细胞核染色质发生边集固缩，在核膜周边聚集形成高电子密度的质块，呈现典型的凋亡细胞形态改变。见插页Ⅴ图4。
2.6流式细胞仪分析细胞凋亡率
AnnexinV/PI双染法是敏感的早期凋亡检测方法 ......
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