异补骨脂素对小鼠胚胎前成骨细胞TGF-β受体影响的实验研究(2)
 |
| 第1页 |
参见附件(4920KB，5页)。
实验细胞： MC3T3-E1、293T细胞购自协和医科大学细胞中心。
1.2 主要试剂与药品
异补骨脂素 中国生物药品检定所。DMEM培养基购自中国医学科学院细胞中心，胎牛血清购自Hyclone公司，硫酸链霉素、青霉素(Hyclone 公司)。MTT购自Sigma公司，DMSO，0.25%胰蛋白酶溶液，天狼星红染液购自Electronic Microscopy Sciences,一抗TGF-βI、TGF-βII(sc-398，sc-400)及二抗购自Santa公司，转染试剂LipofectAMINETM 2000；双荧光素酶报告基因(购自Invitrogen公司)。
2 实验方法
2.1 MTT法检测正常对照组及不同浓度异补骨脂素组MC3T3-E1细胞增殖情况
采用MTT法，以1×10【sup】4【/sup】/孔将细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后，应用无血清培养液培养24h，分别加入经含无水乙醇培养液配制的不同浓度异补骨脂素溶液(10【sup】2【/sup】、10【sup】1【/sup】、10【sup】0【/sup】、10【sup】-1【/sup】、10【sup】-2【/sup】、10【sup】-3【/sup】、10【sup】-4【/sup】、10【sup】-5【/sup】、10【sup】-6【/sup】μM)每组设6个复孔，并设相应正常对照组进行比较，并在培养72时，每组加入MTT至终度为0.5mg/ml；继续培养4h，去除培养液，加入200μlDMSO溶解沉着的色素染料10分钟，上酶标仪检测490nm光吸收值。
2.2 天狼星红染色测定细胞层的胶原含量
去除96孔板中的培养液，-20℃甲醇固定细胞过夜，PBS洗1遍；0.1%天狼星红室温染色1h，去除染液，用0.1%冰醋酸洗3遍，每次5min；每孔加入0.1mol/L氢氧化钠200μL，室温作用1h，振荡混匀，于540nm测光吸收值检测胶原【sup】[4]【/sup】。
2.3 细胞分组
传代细胞分传为5盘细胞(60mm dish细胞培养皿)，细胞融合达60%时，吸出每瓶废液；4mL无血清 DMEM，继续置孵箱孵育，同步24h，使细胞静止于Go；每盘为一组，分为五组：正常组、不同浓度异补骨脂素组。正常组，正常培养；不同浓度异补骨脂素组，含有不同浓度异补骨脂素的培养基培养。各组细胞置37℃、5%CO【sub】2【/sub】孵育箱培养，72h后提取总蛋白。
2.4 荧光素酶报告基因
荧光素酶报告基因(12×CAGA)【sup】[5]【/sup】；按照LipofectAMINETM 2000 提供的方法分别转染293T细胞。转染24 h后，同时分别给予不同浓度的异补骨脂素刺激12h后收获细胞，在荧光酶报告分析仪(Top Count)专用的检测板(一种96 孔板)每个孔中依次加入荧光酶催化底物I，Ⅱ以及上述细胞裂解物，并混匀。利用相应软件程序进行荧光酶活性测定，统计分析，绘图。
2.5 Western bloting检测
2.5.1 细胞浆蛋白提取 小鼠胚胎前成骨细胞(MC3T3-E1)在10%小牛血清DMEM培养传代。于实验前采用无血清DMEM同步24 h,然后以终浓度分别为0、10【sup】-1【/sup】、10【sup】-2【/sup】、10【sup】-3【/sup】、10【sup】-4【/sup】μM含药培养基孵育72h,正常对照组不加异补骨脂素。于实验终点分别提取胞浆蛋白,每瓶加入200μL胞浆裂解液冰上裂解30min,用细胞刮刮下细胞移入一预冷EP管中,4℃下离心20000 r/min×5min立即将上清液移入一预冷EP管中与等体积上样缓冲液混匀后100℃煮沸10min，-20℃备用。
2.5.2 步骤 取等体积上述变性蛋白液，于SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离,其中分离胶与浓缩胶浓度分别为10%、4%。然后将胶进行电转膜,取出膜后4℃封闭过夜加入抗人TGF-β1I,Ⅱ型一抗(sc-398，sc-400),4℃过夜。TBST洗10min×3加二抗37℃孵育1h。再次洗膜后ECL(Thermo)显色, x光胶片曝光后，图片结果进行统计分析。
2.6 统计学方法
利用ImageJ分析软件对结果进行图像分析。各组图像分析结果采用(±s)表示,所有实验数据均采用统计软件SPSS 11.0进行单因素方差分析,P<0.05为有统计学差异。
3 结 果
3.1 MTT法检测异补骨脂素对MC3T3-E1细胞增殖的影响
表1 72h异补骨脂素对成骨细胞增殖的
促进490nm紫外吸收A值(±s)
注：各加药组与同时对照组(异补骨脂素浓度为0μM)比较，◇P<0.05。
MTT结果见表1，对照组细胞排列整齐贴壁生长；用药组细胞亦排列整齐贴壁生长。于72h,异补骨脂素从10【sup】-4【/sup】μM至10【sup】-1【/sup】μM时，能显著促进MC3T3-E1增生(P<0.05)，据此我们知,异补骨脂素对小鼠胚胎前成骨细胞增殖的促进作用具有时间和浓度依赖性。
3.2 天狼星红染色观察异补骨脂素对小鼠胚胎前成骨细胞胶原成分的影响
表2 异补骨脂素干预72h对成骨细胞层胶原合成的
促进540nm紫外吸收A值(±s)
胶原测定结果：胶原经天狼猩红染色后检测结果见表2，异补骨脂素不同程度促进MC3T3-E1细胞分泌Ⅰ型胶原，不同剂量组之间均有统计学意义(P<0.05)，结合上述细胞增殖实验，异补骨脂素浓度从10【sup】-4【/sup】μM至10【sup】-1【/sup】μM呈时间、剂量依赖性促进Ⅰ型胶原的分泌。
3.3 异补骨脂素对各组细胞TGF-β1通路活性的影响
与正常对照组相比各异补骨脂素干预组均可明显激活TGF-β1报告基因，其中以10【sup】-3【/sup】μM异补骨脂素刺激组对荧光素酶表达活性的影响最强，而10【sup】-4【/sup】μM异补骨脂素组则有所减弱。
3.4 异补骨脂素对小鼠胚胎前成骨细胞转化生长因子βⅠ、Ⅱ型受体蛋白的影响
注：1：正常组；2：异补骨脂素10【sup】-1【/sup】μM组；3：异补骨脂素10【sup】-2【/sup】μM组；4：异补骨脂素10【sup】-3【/sup】μM组5：异补骨脂素10【sup】-4【/sup】μM组 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(4920KB，5页)。