基于RSM法优化补骨脂中总呋喃香豆素的提取工艺(1)
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摘 要：目的：采用响应面法(RSM)优化补骨脂中总呋喃香豆素的提取工艺。方法：按照Box-Benhnken设计原理，以液料比、提取温度和聚酰胺用量为主要影响因素，以补骨脂中总呋喃香豆素含量为评价指标，优选最佳提取工艺。结果：最佳提取工艺为加18倍量的甲醇，80℃水浴提取两次(1.5h/次)，滤液加2.1倍量的聚酰胺粉末搅拌均匀，挥干甲醇，上柱，30%乙醇洗脱，在该条件下总呋喃香豆素含量的理论值为1.13%，验证值为1.16%，两者相差2.59%，验证值与理论值相吻合。结论：RSM法优化补骨脂中总呋喃香豆素的提取工艺简便易行，且预测性好，便于实际应用。
关键词：补骨脂；总呋喃香豆素；RSM；Box-Benhnken 中心组合
中图分类号：R285 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2011)04-0793-03
补骨脂为豆科植物补骨脂(Psoralea corylifolia L. )的干燥成熟果实，味辛，苦，归肾、脾经，具有补肾壮阳、纳气、温脾止泻之功效。补骨脂的化学成分主要是香豆素类、黄酮类和单萜类化合物，其香豆素类具有抗肿瘤【sup】[1]【/sup】、抗抑郁【sup】[2]【/sup】、平喘【sup】[3]【/sup】、防治骨质疏松【sup】[4]【/sup】等作用，其中呋喃香豆素类为补骨脂的主要活性物质【sup】[5]【/sup】，由于补骨脂中呋喃香豆素类成分无酚羟基，而其他成分有酚羟基，故本实验采用加热回流的方法从补骨脂中提取总呋喃香豆素，聚酰胺柱层析对总呋喃香豆素进行富集，以总呋喃香豆素含量为考察指标，利用响应面分析法【sup】[6]【/sup】，运用Design–Excerpt软件对影响补骨脂中总呋喃香豆素含的主要因素进行考察和评价，以确定从补骨脂中提取总呋喃香豆素的最佳工艺。
1 仪器与材料
TU-1900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。补骨脂购自本校中药饮片厂，经本校药学院熊耀康教授鉴定为Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实。补骨脂素(批号：110739-200613购自中国药品生物制品检定所)。聚酰胺(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂)。所用试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 聚酰胺的预处理
取聚酰胺以95%乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入柱中。用3～4倍体积的95%乙醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣(或极少残渣)。用2～2.5倍体积5%NaOH溶液洗涤，再用蒸馏水洗至PH值为中性，然后用2～2.5倍体积的10%盐酸溶液洗脱，最后用蒸馏水洗脱至pH中性，烘干备用。
2.2 样品溶液的制备
精密称取补骨脂药材10g，加甲醇适量，加热回流提取1.5h，提取2次，合并滤液，加一定量聚酰胺粉末搅匀后静置，挥干甲醇，装柱，30%乙醇洗脱，洗脱液经干燥后加甲醇溶解，定容后得供试品溶液，备用。
2.3 总香豆素的含量测定【sup】[7]【/sup】
2.3.1 对照品溶液的制备 取补骨脂素对照品4.0mg，精密称定，加甲醇溶解后定容至10mL，再精密吸取1mL，加甲醇定容至25mL，摇匀，即得对照品溶液(每为1mL中含有补骨脂素16μg)。
2.3.2 标准曲线的绘制 精密吸取上述对照品溶液1，3，5，7，10mL，加甲醇定容至10mL，于245nm处测定吸光度，并以吸光度为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线。得标准曲线方程y 123.05x + 0.0082(r 0.9997)。结果表明补骨脂素在1.6～16μg/mL浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。
2.4 RSM法优化总呋喃香豆素提取工艺
2.4.1 实验设计与结果 Box-Benhnken试验是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法【sup】[8]【/sup】。本实验采用软件Design–Excerpt 7.0.0中的Box-Benhnken试验设计原理，选取液料比(A)、提取温度(B)和聚酰胺用量(C)为实验的三因素，每个自变量的低、中、高水平分别以-1、0、1进行编码见表1，以总呋喃香豆素含量(%)为响应值(Y)，响应面分析方案及结果见表2。
表1 实验因素及水平表
2.4.2 模型的建立及方差分析结果 利用Design-Expert 7.0.0软件对表2数据进行多元回归拟合，得到补骨脂总呋喃香豆素提取率(Y)对液料比(A)、提取温度(B)和聚酰胺用量(C)的二次多项回归模型：
Y1.02 + 0.068A + 0.4087B + 0.031C + 0.042AB - 0.023AC + 0.014BC -0.031A【sup】2【/sup】 - 0.057B【sup】2【/sup】 - 0.167C【sup】2【/sup】
表2 响应面分析方案及结果
注：共有15次实验，其中1-12为析因实验，13-15为中心实验，以估计实验误差。
该方程的相关系数R【sup】2【/sup】0.9845，表明响应值Y(总呋喃香豆素提取率)实际值与预测值之间具有较好的拟合度，因此，该模型可以用于预测总呋喃香豆素提取率的实际情况。
从方差分析结果(表3)可知，整体模型达极限著水平(P<0.01)，表明该二次方程模型比较显著，该方程对试验拟合较好，可以对不同条件下的补骨脂中总呋喃香豆素提取率进行预测。由表3可知，A、B、C【sup】2【/sup】达到极显著水平(P<0.01)。C、AB、B【sup】2【/sup】达到显著水平(P<0.05)。因此各具体实验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。另外，该模型的变异系数(C.V)为3.00%，在可接受范围内。
2.4.3 提取工艺的响应面分析与优化 根据回归方程，应用Design-Expert 7.0.0软件，选液料比、提取温度和聚酰胺用量这3个因素，在保持1个因素编码值为0时，其它2个因素与响应值关系的三维响应面图和等高线图，通过图可以直观的描述各因素对响应值(总呋喃香豆素得率)
表3 响应面二次回归方程方差分析
注：*P<0.05；**P<0.01。
的影响和各个因素的交互作用。由图可知，响应曲面均是卷曲向下的凸面，等高线近似为圆形，中心位于所考察区域内，说明在考察的区域范围内存在响应值的极大值，且简单的一次线性方程难以解析。对拟合方程求偏导，可以得到模型的最大值，即补骨脂总香豆素的理论最佳提取工艺条件为：加药材18倍量的甲醇 ......
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