加味小柴胡颗粒及其组方对ITP模型小鼠造血系统的影响(1)
摘要：目的：观察加味小柴胡颗粒及其组方对免疫性血小板减少性紫癜(rrP)模型小鼠血小板计数及骨髓巨核细胞的影响。方法：建立ITP模型小鼠，将之分为7组：正常组、模型组、强的松组、加味小柴胡颗粒组、小柴胡颗粒组、丹参三七颗粒组。于造模后第14天开始分组给药，给药体积为30ml/kg体重，每日给药1次，共14天，分别于给药前后称重；给药前、给药后4天、7天及14天检测血小板计数；实验结束剥离股骨取骨髓测巨核细胞计数和分类。结果：ITP模型小鼠体重增长率下降，血小板计数持续下降，骨髓巨核细胞增加，产板巨减少、成熟度下降，有统计学意义(P0.05)；强的松组、加味小柴胡颗粒、小柴胡颗粒组使巨核细胞数减少，产板巨增高，其中加味小柴胡颗粒组优于小柴胡颗粒组，有统计学意义(P0.05)。结论：加味小柴胡颗粒能提高ITP模型小鼠体重增长率，并明显提升血小板计数，促使骨髓巨核成熟，效果优于雏血宁组，且优于其组方小柴胡颗粒和丹参三七颗粒，与强的松组疗效相似。
关键词：小柴胡颗粒；丹参三七颗粒；ITP；动物模型
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中图分类号：R285.5
文献标识码：A 文章编号：1673—7717(2008)01-0106—03
1 实验材料
1.1 实验动物BALB/C小鼠，体重18-22g，SPF级，雌雄各半。由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。实验动物生产许可证：SCXK(沪)2003—0003。动物生产许可证：实验动物使用许可证：SYXK(苏)2002-0123。
1.2 药品小柴胡颗粒处方按《伤寒论》小柴胡汤，主要成份柴胡、黄芩、法半夏、党参、炙甘草、生姜、大枣，每100g颗粒含生药545g；丹参三七颗粒：每100g颗粒含生药200g；加味小柴胡颗粒：处方按《伤寒论》小柴胡汤加丹参、三七，每100g颗粒含生药418g；以上均由天江制药厂提供；维血宁颗粒：8g，包，无糖型，主要成份熟地黄、地黄、墨旱莲、白芍(炒)、太子参、仙鹤草、鸡血藤、虎杖，江苏天士力制药有限公司生产(批号0512029)；醋酸泼尼松片：5mg/片，浙江仙居制药有限公司(批号040633)。
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1.3 试剂 柠檬酸(C6H802·H：O)，合肥工业大学化学试剂厂，批号：20040401。磷酸二氢钠，南京化学试剂厂，批号030512。枸橼酸三钠(双结晶水)，合肥工业大学化学试剂厂，批号：20040401。ACD溶液，由含双结晶水的枸橼酸三钠2.2g、枸橼酸O.8g和葡萄糖2.5g，加水至100mL制成。
1.4 仪器COULTER AC.T Series Analyzer血细胞计数仪，BECKMAN COULTER公司产品；MELLTER-AE240电子天平，梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司产品；MPl2001电子天平，上海市恒平科学仪器有限公司生产；DK-型电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司产品；LDZ5-2型低速自动平衡离心机，北京医用离心机厂产品。
2 实验方法
2.1 豚鼠抗小鼠血小板血清(APS)制备采集小鼠全血于ACD液中(6：1，pH4.5)，离心分离血小板，然后用0.01M，pH7.4的PBS液洗涤3次并混悬血小板，向每只豚鼠经腹腔注射血小板10致敏。隔1个月如前法进行第2次注射。在第2次注射后第6天，经腹主动脉穿刺采血，取血清，并用洗涤过小鼠红细胞(1：1)及洗涤过的小鼠淋巴细胞(1：1)各吸附2次，分离血清，分装后贮存在冰箱中备用。抗血清活性的测定(ELISA法)：将豚鼠全血抗凝于ACD液中，分离血小板，用0.01M pH7.4的PBS洗涤3次，将血小板调至一定浓度加入40孔反应板，每孔0.1mL，4℃冰箱过夜。反应板洗涤3次后，分别加入1：2、1：4、1：8、1：16、1：32等浓度的抗血清O.1mL，放入37℃温箱孵育1h，以0.01M，pH 7.4的PBS洗涤3次分别再加入适当浓度的酶联葡萄球菌A蛋白，放入37℃温箱1h，再37℃温箱反应30mln，加入2Mh2so4终止反应，用酶标比色计测定OD值，若大于对照2倍OD值为阳性。
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2.2 1TP模型建立参照文献方法，采用注射豚鼠抗小鼠血小板血清(APS)建立小鼠免疫性血小板减少性紫癜模型，按照100g,L/10g体重于腹腔注入1：4稀释的抗血清。造模第6h，血小板开始下降，到8h降至最低。分别于第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19天注射抗血清以维持血小板持续在低水平。
2.3 分组给药于造模后第7天开始分组给药。小鼠共分为7个组，即：(1)正常组：给予等体积蒸馏水。(2)模型组：给予等体积蒸馏水。(3)维血宁组：给予维血宁4.4g/kg体重。(4)强的松组：给予强的松11mg/kg体重。(5)加味小柴胡颗粒组：给予加味小柴胡颗粒16.7g生药/kg体重。(6)小柴胡颗粒组：给予小柴胡颗粒13.8g生药/k异体重。(7)丹参三七颗粒组：给予丹参三七颗粒2.9g生药/lcg体重。各组给药剂量均按小鼠临床等效量计算所得，各组均灌胃给药，给药体积为30mL/k体重，每日给药1次，共给药14天。
2.4 观察指标(1)动物一般状况及体重：分别于给药前和给药后14天称重小鼠。(2)血小板计数：于造模前、给药前、给药1周及实验结束时检测1次，共4次；造模期间取小鼠尾血、造模结束眼球取血，60ul加入带有EDTA—Na2固体抗凝剂的试管中，使血液充分与抗凝剂混合后，采用血细胞计数仪检测。(3)股骨巨核细胞计数及分类：实验结束后处死动物，迅速剥离股骨。取出股骨骨髓，用25uL小牛血清混匀，迅速涂片，风干后瑞氏染色，用光学显微镜观察，每张骨髓片以直径6mm的圆内细胞数目为基准，光镜下观察全片巨核细胞数，并根据形态特点将巨核细胞分为4型：原幼巨核细胞、颗粒巨核细胞、裸巨细胞、产板巨核细胞。
3 结果
3.1 对ITP小鼠一般状况及体重增长的影响 动物第1次给予ASP 3h后，活动力明显减少，呼吸较正常组加快。给药前，各组动物体重均低于正常组(p<0.01)，表明造模后小鼠体重增长缓慢。给药14天后，强的松组体重增长率低于模型组(P<0.01)，其余各给药组小鼠体重增长率均高于模型组，其中加味小柴胡颗粒组体重增长率与模型组相比，有显著性差异(P<0.01)。提示加味小柴胡颗粒, 百拇医药(王 缨 夏卫军)
关键词：小柴胡颗粒；丹参三七颗粒；ITP；动物模型
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中图分类号：R285.5
文献标识码：A 文章编号：1673—7717(2008)01-0106—03
1 实验材料
1.1 实验动物BALB/C小鼠，体重18-22g，SPF级，雌雄各半。由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。实验动物生产许可证：SCXK(沪)2003—0003。动物生产许可证：实验动物使用许可证：SYXK(苏)2002-0123。
1.2 药品小柴胡颗粒处方按《伤寒论》小柴胡汤，主要成份柴胡、黄芩、法半夏、党参、炙甘草、生姜、大枣，每100g颗粒含生药545g；丹参三七颗粒：每100g颗粒含生药200g；加味小柴胡颗粒：处方按《伤寒论》小柴胡汤加丹参、三七，每100g颗粒含生药418g；以上均由天江制药厂提供；维血宁颗粒：8g，包，无糖型，主要成份熟地黄、地黄、墨旱莲、白芍(炒)、太子参、仙鹤草、鸡血藤、虎杖，江苏天士力制药有限公司生产(批号0512029)；醋酸泼尼松片：5mg/片，浙江仙居制药有限公司(批号040633)。
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1.3 试剂 柠檬酸(C6H802·H：O)，合肥工业大学化学试剂厂，批号：20040401。磷酸二氢钠，南京化学试剂厂，批号030512。枸橼酸三钠(双结晶水)，合肥工业大学化学试剂厂，批号：20040401。ACD溶液，由含双结晶水的枸橼酸三钠2.2g、枸橼酸O.8g和葡萄糖2.5g，加水至100mL制成。
1.4 仪器COULTER AC.T Series Analyzer血细胞计数仪，BECKMAN COULTER公司产品；MELLTER-AE240电子天平，梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司产品；MPl2001电子天平，上海市恒平科学仪器有限公司生产；DK-型电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司产品；LDZ5-2型低速自动平衡离心机，北京医用离心机厂产品。
2 实验方法
2.1 豚鼠抗小鼠血小板血清(APS)制备采集小鼠全血于ACD液中(6：1，pH4.5)，离心分离血小板，然后用0.01M，pH7.4的PBS液洗涤3次并混悬血小板，向每只豚鼠经腹腔注射血小板10致敏。隔1个月如前法进行第2次注射。在第2次注射后第6天，经腹主动脉穿刺采血，取血清，并用洗涤过小鼠红细胞(1：1)及洗涤过的小鼠淋巴细胞(1：1)各吸附2次，分离血清，分装后贮存在冰箱中备用。抗血清活性的测定(ELISA法)：将豚鼠全血抗凝于ACD液中，分离血小板，用0.01M pH7.4的PBS洗涤3次，将血小板调至一定浓度加入40孔反应板，每孔0.1mL，4℃冰箱过夜。反应板洗涤3次后，分别加入1：2、1：4、1：8、1：16、1：32等浓度的抗血清O.1mL，放入37℃温箱孵育1h，以0.01M，pH 7.4的PBS洗涤3次分别再加入适当浓度的酶联葡萄球菌A蛋白，放入37℃温箱1h，再37℃温箱反应30mln，加入2Mh2so4终止反应，用酶标比色计测定OD值，若大于对照2倍OD值为阳性。
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2.2 1TP模型建立参照文献方法，采用注射豚鼠抗小鼠血小板血清(APS)建立小鼠免疫性血小板减少性紫癜模型，按照100g,L/10g体重于腹腔注入1：4稀释的抗血清。造模第6h，血小板开始下降，到8h降至最低。分别于第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19天注射抗血清以维持血小板持续在低水平。
2.3 分组给药于造模后第7天开始分组给药。小鼠共分为7个组，即：(1)正常组：给予等体积蒸馏水。(2)模型组：给予等体积蒸馏水。(3)维血宁组：给予维血宁4.4g/kg体重。(4)强的松组：给予强的松11mg/kg体重。(5)加味小柴胡颗粒组：给予加味小柴胡颗粒16.7g生药/kg体重。(6)小柴胡颗粒组：给予小柴胡颗粒13.8g生药/k异体重。(7)丹参三七颗粒组：给予丹参三七颗粒2.9g生药/lcg体重。各组给药剂量均按小鼠临床等效量计算所得，各组均灌胃给药，给药体积为30mL/k体重，每日给药1次，共给药14天。
2.4 观察指标(1)动物一般状况及体重：分别于给药前和给药后14天称重小鼠。(2)血小板计数：于造模前、给药前、给药1周及实验结束时检测1次，共4次；造模期间取小鼠尾血、造模结束眼球取血，60ul加入带有EDTA—Na2固体抗凝剂的试管中，使血液充分与抗凝剂混合后，采用血细胞计数仪检测。(3)股骨巨核细胞计数及分类：实验结束后处死动物，迅速剥离股骨。取出股骨骨髓，用25uL小牛血清混匀，迅速涂片，风干后瑞氏染色，用光学显微镜观察，每张骨髓片以直径6mm的圆内细胞数目为基准，光镜下观察全片巨核细胞数，并根据形态特点将巨核细胞分为4型：原幼巨核细胞、颗粒巨核细胞、裸巨细胞、产板巨核细胞。
3 结果
3.1 对ITP小鼠一般状况及体重增长的影响 动物第1次给予ASP 3h后，活动力明显减少，呼吸较正常组加快。给药前，各组动物体重均低于正常组(p<0.01)，表明造模后小鼠体重增长缓慢。给药14天后，强的松组体重增长率低于模型组(P<0.01)，其余各给药组小鼠体重增长率均高于模型组，其中加味小柴胡颗粒组体重增长率与模型组相比，有显著性差异(P<0.01)。提示加味小柴胡颗粒, 百拇医药(王 缨 夏卫军)