SYBR green实时荧光定量PCR检测VEGF mRNA方法的建立(2)
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1.2.3 标准曲线的绘制：根据标准品质粒pGEM-GAPDH、pIRES2-EGFP-VEGF定量结果和片断大小，查阅《分子克隆(第三版)》第1664页，得出质粒的拷贝浓度，后将其稀释为以下五个拷贝浓度(单位：拷贝/μl)，分别为pGEM-GAPDH：108，107，106，105，104 拷贝/μl，pIRES2-EGFP-VEGF为107，106，105，104，103 拷贝/μl，作为mRNA 定量的标准品，以此绘制标准曲线。
1.2.4 SYBR green 实时荧光定量PCR 检测VEGF mRNA 水平：实验分四组，分别为正常皮肤组、烧伤瘢痕组、A2058组和WM793组；反应体系为cDNA 模板1μl，上下游引物1μl，2×SYBR Premix EX Taq 10μl，水补至20μl；反应参数为95 ℃10s，57℃15s，72℃15s，荧光检测1次，共45个循环，从70 ℃至95℃，每0.4℃/s 为间隔绘制熔解曲线，反应结束后根据熔解曲线分析产物特异性。每组设3个复孔，即n＝3。
1.2.5 统计学分析：数据采用SPSS13.0统计软件进行分析，形式均采用x±s表示，数据处理应用单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05 表示有统计学差异。
2结果
2.1 GAPDH 和VEGF 的标准曲线：根据GAPDH 和VEGF 质粒DNA 定量结果，将其倍比稀释，行PCR后可见所得扩增曲线为典型的倒S形曲线，从左至右质粒DNA 浓度依次以10倍递减，且模板浓度越高，其循环阈值即Ct 越小，且五个样本基本处于一条直线，GAPDH 的相关系数r 为1，斜率为 -0.2869(图1-A)，VEGF 的r 值为1，斜率为 -0.3064(图1-B)，说明荧光定量PCR的质量控制较好，符合下步定量实验要求。
2.2 PCR产物特异度分析：各组样本的VEGF荧光定量PCR 前，观察熔解曲线，以熔解曲线峰值的一致性，检测产物的特异度，也是结果是否准确可信的重要参考指标 ......
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