LMP1经Wnt1/β—catenin途径促进鼻咽癌干细胞SP18增殖(1)
摘 要：目的 探讨LMP1羧基端功能活性区促进鼻咽癌干细胞SP18增殖作用机制。方法 采用生长曲线、平皿克隆形成实验与软琼脂集落实验分析LMP1TRADD对SP18细胞增殖的作用；運用Western-blot检测SP18细胞中Wnt1、β-catenin与p-β-catenin蛋白的表达。结果 SP18-LMP1TRADD细胞的增殖能力较SP18-LMP1细胞减弱(P<0.01)；与SP18-LMP1细胞比较，SP18-LMP1TRADD细胞中Wnt1与β-catenin表达降低，而p-β-catenin蛋白表达增加(P<0.01)。结论 LMP1经Wnt1/β-catenin途径促进鼻咽癌干细胞SP18的增殖。
关键词：鼻咽癌干细胞；LMP1；Wnt1/β-catenin通路；细胞增殖
中图分类号：R318.0 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.07.024
, http://www.100md.com
文章编号：1006-1959(2018)07-0075-03
LMP1 through Wnt1/β-catenin Pathway to Promote the Proliferation of SP18 in Nasopharyngeal Carcinoma Stem Cells
ZHOU Ye，ZHANG He-liang，LIU Zhong-yuan，LUO Zhao-yang，ZHANG Zhi-wei
( Key Laboratory of Tumor Cell and Molecular Pathology，Institute of Oncology，School of Medicine，South China University，Hengyang， 421001，Hunan，China)
Abstract：Objective To investigate the mechanism of the carboxyl-terminal functional active region of LMP1 in promoting proliferation of nasopharyngeal carcinoma SP18 stem cells.Methods Growth curve，plate colony formation assay and soft agar colony assay were used to analyze the effect of LMP1TRADD on the proliferation of SP18 cells.The expression of Wnt1，β -catenin and p-β-catenin in SP18 cells was detected by Western-blot.Results The proliferative ability of SP18-LMP1TRADD cells was lower than that of SP18-LMP1 cells(P<0.01)，compared with SP18-LMP1 cells， the expression of Wnt1 and β-catenin in SP18-LMP1TRADD cells decreased，while the expression of p-β-catenin protein increased(P<0.01).Conclusion LMP1 can promote the proliferation of SP18 in nasopharyngeal carcinoma stem cells via Wnt1/β-catenin pathway.
, 百拇医药
Key words：Nasopharyngeal carcinoma stem cells；LMP1；Wnt1/β-catenin pathway；Cell proliferation
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国广东、广西、湖南和香港等南方地区最常见的头颈部恶性肿瘤。大量研究证实，EB病毒感染与NPC发病密切相关[1]。鼻咽癌干细胞在鼻咽癌转移、复发、放疗抵抗与耐药的发挥重要作用。潜伏性膜蛋白1(latent membrane protein 1，LMP1)是EB病毒编码的重要致瘤蛋白之一[2-4]。LMP1羧基末端包括三个功能活化区(carboxy terminal activating region，CTAR)，即CTAR1、CTAR2和CTAR3[5-7]，其中CTAR2区域包含有肿瘤坏死因子受体相关死亡区(TRADD)，是活性区重要的转化位点[7-9]。然而，LMP1表达对鼻咽癌干细胞生长增殖的影响及分子机制仍不十分清楚。
, 百拇医药
1材料与方法
1.1细胞与质粒 鼻咽癌干细胞SP18由中山大学肿瘤研究所建立并惠赠，细胞培养采用低血清(2%～5%)血清(购自杭州四季青公司)的RPMI1640(Gibco BRL公司)培养。逆病毒质粒pLNSX-LMP1和pLNSX-LMP1TRADD(LMP1的CTAR2区域TRADD突变)[5-7]由中南大学肿瘤研究所构建并惠赠。
1.2细胞生长曲线 取2×103个SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞接种于24孔板种中，每组均接种3个平行孔细胞，培养24 h后，每天2组取3孔细胞计数，重复计数3次，取均值为每组细胞数，连续计数细胞6 d，将所得不同时间计数细胞数连接后，绘制出细胞生长曲线。
1.3平板克隆形成实验 分别取300个SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞接种于24孔板中，每组均接种3个平行孔，将24孔板置于培养箱中培养2周后，观察细胞克隆形成情况，每孔加入1 ml甲醇进行细胞固定1 h后，加入0.5 ml的0.4%结晶紫染色15 min，肉眼计数细胞克隆，每孔重复计数3次，取3孔均值为每组克隆数，然后计算细胞克隆形成率，为形成克隆数比接种细胞数即为克隆形成率。, 百拇医药(周业 张和良 刘重元 罗招阳 张志伟)
关键词：鼻咽癌干细胞；LMP1；Wnt1/β-catenin通路；细胞增殖
中图分类号：R318.0 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.07.024
, http://www.100md.com
文章编号：1006-1959(2018)07-0075-03
LMP1 through Wnt1/β-catenin Pathway to Promote the Proliferation of SP18 in Nasopharyngeal Carcinoma Stem Cells
ZHOU Ye，ZHANG He-liang，LIU Zhong-yuan，LUO Zhao-yang，ZHANG Zhi-wei
( Key Laboratory of Tumor Cell and Molecular Pathology，Institute of Oncology，School of Medicine，South China University，Hengyang， 421001，Hunan，China)
Abstract：Objective To investigate the mechanism of the carboxyl-terminal functional active region of LMP1 in promoting proliferation of nasopharyngeal carcinoma SP18 stem cells.Methods Growth curve，plate colony formation assay and soft agar colony assay were used to analyze the effect of LMP1TRADD on the proliferation of SP18 cells.The expression of Wnt1，β -catenin and p-β-catenin in SP18 cells was detected by Western-blot.Results The proliferative ability of SP18-LMP1TRADD cells was lower than that of SP18-LMP1 cells(P<0.01)，compared with SP18-LMP1 cells， the expression of Wnt1 and β-catenin in SP18-LMP1TRADD cells decreased，while the expression of p-β-catenin protein increased(P<0.01).Conclusion LMP1 can promote the proliferation of SP18 in nasopharyngeal carcinoma stem cells via Wnt1/β-catenin pathway.
, 百拇医药
Key words：Nasopharyngeal carcinoma stem cells；LMP1；Wnt1/β-catenin pathway；Cell proliferation
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国广东、广西、湖南和香港等南方地区最常见的头颈部恶性肿瘤。大量研究证实，EB病毒感染与NPC发病密切相关[1]。鼻咽癌干细胞在鼻咽癌转移、复发、放疗抵抗与耐药的发挥重要作用。潜伏性膜蛋白1(latent membrane protein 1，LMP1)是EB病毒编码的重要致瘤蛋白之一[2-4]。LMP1羧基末端包括三个功能活化区(carboxy terminal activating region，CTAR)，即CTAR1、CTAR2和CTAR3[5-7]，其中CTAR2区域包含有肿瘤坏死因子受体相关死亡区(TRADD)，是活性区重要的转化位点[7-9]。然而，LMP1表达对鼻咽癌干细胞生长增殖的影响及分子机制仍不十分清楚。
, 百拇医药
1材料与方法
1.1细胞与质粒 鼻咽癌干细胞SP18由中山大学肿瘤研究所建立并惠赠，细胞培养采用低血清(2%～5%)血清(购自杭州四季青公司)的RPMI1640(Gibco BRL公司)培养。逆病毒质粒pLNSX-LMP1和pLNSX-LMP1TRADD(LMP1的CTAR2区域TRADD突变)[5-7]由中南大学肿瘤研究所构建并惠赠。
1.2细胞生长曲线 取2×103个SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞接种于24孔板种中，每组均接种3个平行孔细胞，培养24 h后，每天2组取3孔细胞计数，重复计数3次，取均值为每组细胞数，连续计数细胞6 d，将所得不同时间计数细胞数连接后，绘制出细胞生长曲线。
1.3平板克隆形成实验 分别取300个SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD细胞接种于24孔板中，每组均接种3个平行孔，将24孔板置于培养箱中培养2周后，观察细胞克隆形成情况，每孔加入1 ml甲醇进行细胞固定1 h后，加入0.5 ml的0.4%结晶紫染色15 min，肉眼计数细胞克隆，每孔重复计数3次，取3孔均值为每组克隆数，然后计算细胞克隆形成率，为形成克隆数比接种细胞数即为克隆形成率。, 百拇医药(周业 张和良 刘重元 罗招阳 张志伟)