芪术颗粒对肝纤维化形成过程中磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸蛋白激酶信号传导通路的影响(2)
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参见附件。
1.2药物
芪术颗粒,批号20110902,本院制剂室提供。
1.3试剂
四氯化碳,分析纯,国药集团化学试剂有限公司提供,批号20110401；橄榄油,分析纯,北京化学试剂公司；Caspase9抗体(CST,货号：9665S),p-Akt (Thr308)抗体(CST,货号：4056S),p-Akt(Ser473)抗体(CST,货号：4060S),p-Bad抗体(CST,货号：9295S)。
1.4仪器
低速大容量多管离心机,上海安亭科学仪器厂；DYCZ-22A垂直电泳槽、DYY-7B转移电泳仪及DYCZ-40B转移电泳槽,北京市六一仪器厂；DG-3A型水平电泳槽,北京鼎国生物技术发展中心；凝胶成像分析仪,美国UVP公司。
2实验方法
2.1分组、造模与给药
大鼠适应性喂养1周后,随机分为正常组、实验对照组、模型组、芪术颗粒组。模型组和芪术颗粒组大鼠用10%CCl4橄榄油溶液按3 mL/kg剂量腹腔注射造模,每周2次；实验对照组腹腔注射10%橄榄油溶液,剂量为3 mL/kg。第1次造模后即预防给药,芪术颗粒组2 g/(kg搠)灌胃,容积为1.0 mL/100 g体质量。实验对照组、模型组给予等体积无菌水,正常组正常喂养。连续4周。各组均每周称重1次,依体质量调整给药剂量。
2.2取材
第1次腹腔注射后第1、2、4周时点,各组分别处死4只大鼠,取肝组织200～250 mg,置于-80 ℃液氮中保存,备用。
2.3肝组织Caspase9、p-Akt(Ser473)、Bad(Ser136)及p-Akt(Thr308)表达检测
2.3.1Western Blot免疫印迹法检测肝组织细胞总蛋白质的提取：取液氮保存的肝组织100 mg,经冰冷的PBS清洗后置入玻璃匀浆器中,加入预冷的组织裂解液(10%W/V,20 mmol/L Tris-HCl、2.5 mmol/L EDTA、10%甘油、0.1%SDS、1%Triton X-100,1%去氧胆酸钠、10 mmol/L焦磷酸钠、50 mmol/L氟化钠、1 mmol/L矾酸钠、1 mmol/L苯*****)1 mL,将准备好的肝组织剪碎,然后在冰浴上用玻璃匀浆器充分研磨制成匀浆,并在冰浴中静置30 min,使蛋白质充分裂解,4 ℃、12 000 r/min离心30 min,吸取上清即为蛋白质溶液,-80 ℃冰箱保存,备用。
2.3.2肝组织蛋白浓度测定将考马斯亮蓝原液用三蒸水1∶4稀释,用生理盐水将标准蛋白稀释至终浓度为1 mg/mL ......
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