氧化苦参碱对慢性乙型病毒性肝炎Toll样受体9信号通路的影响(2)
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参见附件。
1.6单个核细胞制备
取患者外周静脉全血40 mL,肝素抗凝,密度梯度离心获得人PBMCs,悬浮于1640培养基(含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、1.5 mmol/L
L-谷氨酰胺),调整细胞浓度为1×106/mL,台盼蓝染色实验判断细胞存活状态(>98%)。
1.7RNA提取及实时定量聚合酶链反应
将PBMCs分为2组,一组加入氧化苦参碱刺激,另一组不加刺激剂。48 h后收集细胞,按照TRIzol试剂盒说明书操作指南提取RNA。
取1 μg总RNA,加入随机引物制备cDNA。cDNA采用实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)进行扩增分析(Bio-Rad Laboratories,INC.CA.USA.),并采用2-Ct方法进行计算[11]。real-time PCR 25 μL反应体系按照说明书严格执行。real-time PCR反应条件：95 ℃、5 min,随后进行45个循环(95 ℃、15 s, 60 ℃、30 s,72 ℃、30 s)。在每循环的最后一个阶段检测反应体系的荧光强度。待扩增的基因引物及内参见表1。其中,MyD88为髓样分化因子88,TRAF6为肿瘤坏死因子受体相关因子6,IRF7为干扰素调节因子7,β-actin为内参基因。
表1待扩增基因引物及内参
基因引物序列(5’端到3’端)
TLR9F：CGGCATCTCAACCTCAAGTGR：CCAGTTTGACGATGCGGTTG
MyD88F：CGGCAACTGGAGACACAAGCR：GGGCAATAGCAGATGAAGGC
TRAF6F：TGGAAGATTGGCAACTTTGGR：GGTAACTGAAGGTGCAAGC
IRF7F：TCCAGGCAGTGCAACAGAGCR：GGAGCCTTGGTTGGGACTG
β-actinF：CCTGGGCATGGAGTCCTGTGR：TCTTCATTGTGCTGGGTGCC
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