甲基斑蝥胺片对Beagle犬尿液微量蛋白和尿酶的影响(1)
[摘要]目的：探讨甲基斑蝥胺片对Beagle犬肾毒性以及对其尿液微量蛋白和尿酶的影响。方法：24只Beagle犬，雌雄各半，随机分4组，每组6只，即阴性对照组(空白片)、甲基斑蝥胺片6.11，12.21，24.42 mg·kg-1剂量组，连续口服给药30 d，每天1次。药物组及对照组Beagle犬在给药后1，2，3，4周，进行新鲜尿液采集，将尿液进行尿常规检测；给药第15，30天检测血清尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)、总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)以及钠、钾、氯电解质；给药第15，30天检测尿液微量白蛋白(mAlb)、肾脏损伤分子-1(KIM-1)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、丛生蛋白( clusterin)、β2-微球蛋白(β2-MG)、α1-微球蛋白(α1-MG)、丙氨酸氨肽酶(AAP)和免疫球蛋白IgG。结果：与对照组相比，各剂量组尿液中尿蛋白和白细胞增加；连续15 d口服甲基斑蝥胺，各剂量组mAlb均升高，其中高剂量组KIM-1，NGAL，clusterin，NAG和AAP含量均明显升高，中、低剂量组未见统计学差异，同时血SCr和BUN未见明显异常；连续30 d给药后，各剂量组mAlb，KIM-1，clusterin，NAG，AAP均升高，呈量效关系，其中高剂量组NGAL及β2-MG含量明显升高。以上指标的含量均随着剂量的增加及时间的延长而明显升高，与血清中BUN，SCr呈相关性，提示尿液mAlb，KIM-1，clusterin，NAG和AAP指标，能够灵敏反映微量尿蛋白和尿酶的变化。结论：甲基斑蝥胺片具有一定的肾脏毒性，尿液mAlb，KIM-1，clusterin，NAG和AAP指标可做为评价甲基斑蝥胺早期肾毒性的生物标志物。
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[关键词]甲基斑蝥胺；肾毒性；尿酶；尿蛋白
斑蝥为芫菁科昆虫南方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas或黄黑小斑蝥M. cichorii Linnaeus的干燥全虫，现代药学研究表明其主要药用成分是斑蝥素。近年来对斑蝥素衍生物的研制和新剂型的开发方面，相继合成了多种斑蝥素衍生物，如甲基斑蝥胺、斑蝥酸钠、羟基斑蝥胺、去甲斑蝥素等[1]。斑蝥素在治疗癌症和一些疑难杂症方面显示出独特的疗效，但其毒性大，对心、肾器官有实质性损伤，因此在应用上受到很大限制[2]。而甲基斑蝥胺系斑蝥素的亚胺类衍生物，具有干扰癌细胞的核酸和蛋白质代谢，能明显抑制多种动物移植性肿瘤作用，对动物实体瘤作用优于斑蝥素[3]，同时还有抗乙型肝炎病毒[4]，升高白细胞作用，在体外具有一定的抗HBV活性，临床主要应用于治疗原发性肝癌，但具有一定肾脏毒性。肾脏毒性主要表现为肾小球的滤过功能下降，体内的代谢产物蓄积，导致血清中尿素氮、肌酐含量明显提高，同时肾小管上皮细胞有脱落及少数坏死。尿内含有许多酶，从尿酶的检测可以推断肾损害部位和程度， 正常情况下尿酶活性几乎测不出，当肾脏病变或受到损害时，尿酶活性即升高。由于尿酶活性升高常常早于血清肌酐、尿素氮及内生肌酐清除率等其他肾功能障碍指标，因此尿酶检测可作为早期肾功能损害指标[5]。
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本项目通过Beagle犬连续30 d口服甲基斑蝥胺后，检测不同给药时间及不同给药剂量Beagle犬的血液生化、尿液微量蛋白和尿酶的变化，探索能够做为评价甲基斑蝥胺肾毒性的生物标志物，对完善评价现代中药肾毒性的安全性评价技术体系，指导临床合理、安全、有效用药均有理论意义和实用价值。
1材料
1.1药物与试剂甲基斑蝥胺片(重庆市中药研究院制药厂提供，批号110901)；尿液微量白蛋白(mAlb)、肾脏损伤分子-1(KIM-1)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、丛生蛋白(clusterin)测试盒(美国ADL)；goat anti-dog MiSCroalbunminuria ELISA测定试剂盒(Lot No：RT120371，RT120396)；尿β2-微球蛋白(β2-MG)、α1-微球蛋白(α1-MG)、丙氨酸氨肽酶(AAP)、免疫球蛋白IgG测试盒(南京建成生物工程研究所，批号20120211，20120119)。总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)和肌酐(Crea)试剂盒(四川省迈克科技有限责任公司，批号1209061，1209091)。尿试纸(日本ARKRAYFACTORY公司，批号OEA8G85)；电解质(K+，Na+，Cl-)试剂(深圳越华科技公司，批号20120206)。
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1.2动物26只Beagle犬，雌雄各半，普通级，合格证号SCXK(川)2008-01，四川省养麝研究所Beagle犬养殖场提供。
1.3仪器DT-100K电子天平(常熟市金羊砝码仪器有限公司)；Allegra X-12离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)；7020型全自动生化分析仪(日本日立集团产业株式会社)；MI-921电解质分析仪(深圳市越华科技发展有限公司)；酶标仪(Thermo Lab systems公司)；AM-4290尿分析仪(日本京都第一科学)。
2方法
2.1剂量设计甲基斑蝥胺片灌胃半数致死量LD50为813.7 mg·kg-1，换算成Beagle犬LD50为122.06 mg·kg-1，本试验高剂量设计为1/5 Beagle犬LD50，即高、中、低剂量按4∶2∶1设为24.42，12.21，6.11 mg·kg-1。
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2.2分组、给药及检测取健康Beagle犬26只，雌雄各半。含购入日15 d，检疫、驯化一同进行。饲养期间，对于外观、一般状态观察出现异常，可能对实验有影响的动物在实验时不得使用。在购入第8，13天进行血液生化、尿液检测。从中选取各指标无明显异常的24只动物，雌雄各半，分别按体重随机分为4组，每组6只。即阴性对照组(空白片)、甲基斑蝥胺片低、中、高剂量组(6.11，12.21，24.42 mg·kg-1)。给药频率： 每天1次，连续口服给药30 d，每星期固定时间称体重，根据Beagle犬体重调整给药量。药物组及对照组Beagle犬在给药后1，2，3，4周，用清洁托盘进行新鲜尿液采集，将采集的新鲜尿液用AM-4290尿液分析仪进行检测，检测指标包括尿液比重(SC)、pH(PH)、尿糖(GLU)、尿蛋白(Pro)、尿胆红素(Bil)、尿胆原(Uro)、酮体(Ket)、潜血(Bld)、亚硝酸盐(Nit)、白细胞(Leu)、颜色等；给药第15，30天进行7020型全自动生化分析仪检测尿素氮(BUN，二乙酰乙肟法)、肌酐(Crea，苦味酸法)和总蛋白和白蛋白(TP，双缩脲法；ALB，溴甲酚绿比色法)以及MI-921电解质分析仪测定钠、钾、氯电解质(电极电位法)；给药第15，30天采用ELISA试剂盒检测mAlb，KIM-1，NGAL，NAG，clusterin，β2-MG，α1-MG，AAP和免疫球蛋白IgG。, 百拇医药(罗先钦 杨雪 胡荣 黄文涛 兰波 涂如霞 刘剑毅)
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[关键词]甲基斑蝥胺；肾毒性；尿酶；尿蛋白
斑蝥为芫菁科昆虫南方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas或黄黑小斑蝥M. cichorii Linnaeus的干燥全虫，现代药学研究表明其主要药用成分是斑蝥素。近年来对斑蝥素衍生物的研制和新剂型的开发方面，相继合成了多种斑蝥素衍生物，如甲基斑蝥胺、斑蝥酸钠、羟基斑蝥胺、去甲斑蝥素等[1]。斑蝥素在治疗癌症和一些疑难杂症方面显示出独特的疗效，但其毒性大，对心、肾器官有实质性损伤，因此在应用上受到很大限制[2]。而甲基斑蝥胺系斑蝥素的亚胺类衍生物，具有干扰癌细胞的核酸和蛋白质代谢，能明显抑制多种动物移植性肿瘤作用，对动物实体瘤作用优于斑蝥素[3]，同时还有抗乙型肝炎病毒[4]，升高白细胞作用，在体外具有一定的抗HBV活性，临床主要应用于治疗原发性肝癌，但具有一定肾脏毒性。肾脏毒性主要表现为肾小球的滤过功能下降，体内的代谢产物蓄积，导致血清中尿素氮、肌酐含量明显提高，同时肾小管上皮细胞有脱落及少数坏死。尿内含有许多酶，从尿酶的检测可以推断肾损害部位和程度， 正常情况下尿酶活性几乎测不出，当肾脏病变或受到损害时，尿酶活性即升高。由于尿酶活性升高常常早于血清肌酐、尿素氮及内生肌酐清除率等其他肾功能障碍指标，因此尿酶检测可作为早期肾功能损害指标[5]。
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本项目通过Beagle犬连续30 d口服甲基斑蝥胺后，检测不同给药时间及不同给药剂量Beagle犬的血液生化、尿液微量蛋白和尿酶的变化，探索能够做为评价甲基斑蝥胺肾毒性的生物标志物，对完善评价现代中药肾毒性的安全性评价技术体系，指导临床合理、安全、有效用药均有理论意义和实用价值。
1材料
1.1药物与试剂甲基斑蝥胺片(重庆市中药研究院制药厂提供，批号110901)；尿液微量白蛋白(mAlb)、肾脏损伤分子-1(KIM-1)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、丛生蛋白(clusterin)测试盒(美国ADL)；goat anti-dog MiSCroalbunminuria ELISA测定试剂盒(Lot No：RT120371，RT120396)；尿β2-微球蛋白(β2-MG)、α1-微球蛋白(α1-MG)、丙氨酸氨肽酶(AAP)、免疫球蛋白IgG测试盒(南京建成生物工程研究所，批号20120211，20120119)。总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)和肌酐(Crea)试剂盒(四川省迈克科技有限责任公司，批号1209061，1209091)。尿试纸(日本ARKRAYFACTORY公司，批号OEA8G85)；电解质(K+，Na+，Cl-)试剂(深圳越华科技公司，批号20120206)。
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1.2动物26只Beagle犬，雌雄各半，普通级，合格证号SCXK(川)2008-01，四川省养麝研究所Beagle犬养殖场提供。
1.3仪器DT-100K电子天平(常熟市金羊砝码仪器有限公司)；Allegra X-12离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)；7020型全自动生化分析仪(日本日立集团产业株式会社)；MI-921电解质分析仪(深圳市越华科技发展有限公司)；酶标仪(Thermo Lab systems公司)；AM-4290尿分析仪(日本京都第一科学)。
2方法
2.1剂量设计甲基斑蝥胺片灌胃半数致死量LD50为813.7 mg·kg-1，换算成Beagle犬LD50为122.06 mg·kg-1，本试验高剂量设计为1/5 Beagle犬LD50，即高、中、低剂量按4∶2∶1设为24.42，12.21，6.11 mg·kg-1。
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2.2分组、给药及检测取健康Beagle犬26只，雌雄各半。含购入日15 d，检疫、驯化一同进行。饲养期间，对于外观、一般状态观察出现异常，可能对实验有影响的动物在实验时不得使用。在购入第8，13天进行血液生化、尿液检测。从中选取各指标无明显异常的24只动物，雌雄各半，分别按体重随机分为4组，每组6只。即阴性对照组(空白片)、甲基斑蝥胺片低、中、高剂量组(6.11，12.21，24.42 mg·kg-1)。给药频率： 每天1次，连续口服给药30 d，每星期固定时间称体重，根据Beagle犬体重调整给药量。药物组及对照组Beagle犬在给药后1，2，3，4周，用清洁托盘进行新鲜尿液采集，将采集的新鲜尿液用AM-4290尿液分析仪进行检测，检测指标包括尿液比重(SC)、pH(PH)、尿糖(GLU)、尿蛋白(Pro)、尿胆红素(Bil)、尿胆原(Uro)、酮体(Ket)、潜血(Bld)、亚硝酸盐(Nit)、白细胞(Leu)、颜色等；给药第15，30天进行7020型全自动生化分析仪检测尿素氮(BUN，二乙酰乙肟法)、肌酐(Crea，苦味酸法)和总蛋白和白蛋白(TP，双缩脲法；ALB，溴甲酚绿比色法)以及MI-921电解质分析仪测定钠、钾、氯电解质(电极电位法)；给药第15，30天采用ELISA试剂盒检测mAlb，KIM-1，NGAL，NAG，clusterin，β2-MG，α1-MG，AAP和免疫球蛋白IgG。, 百拇医药(罗先钦 杨雪 胡荣 黄文涛 兰波 涂如霞 刘剑毅)