黄独素B诱导小鼠急性肝损伤及其机制(1)
[摘要] 目的：观察黄药子中的二萜内酯类成分diosbulbin B(DB)诱导的急性肝毒性，并进一步探讨其对小鼠血清中炎性细胞因子和肝脏血红素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)表达的影响。方法：小鼠一次性灌胃给药DB(0，113，150，200 mg·kg-1)，通过检测血清谷丙转氨酶(ALT)，天冬氨酸转氨酶(AST)，碱性磷酸酶(ALP)的活性来观察DB诱导的急性肝损伤，采用酶联免疫法(ELISA)检测血清中肿瘤坏死因子α (TNF-α)，白细胞介素4(IL-4)，白细胞介素1β (IL-1β)的含量，采用免疫印迹法(Western blot)观察HO-1的表达。结果：血清ALT，AST，ALP结果显示，DB 113 mg·kg-1灌胃后24 h，DB没有引起肝毒性；在150 mg·kg-1时，DB引起微弱的肝损伤；到200 mg·kg-1时，DB诱导明显的肝损伤。ELISA结果显示，DB能够剂量依赖性的增加血清中TNF-α的含量(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，DB(200 mg·kg-1)能够降低 IL-4的含量(P<0.01)，而不同剂量的DB对IL-1β的含量均没有明显影响。Western blot结果显示，DB(200 mg·kg-1)能够明显诱导肝组织中HO-1的表达(P<0.01)。结论：由TNF-α介导的炎性肝损伤以及氧化应激损伤可能是DB所诱导的急性肝毒性的主要原因。
, 百拇医药
[关键词] 黄药子；diosbulbin B；肝毒性；炎性肝损伤；氧化应激
黄药子为薯蓣科薯蓣属植物黄独Dioscorea bulbifera L.的地下块茎，药性苦寒，具有散结消瘿、清热解毒、凉血止血的作用。临床上除用于甲状腺疾病外，还常将黄药子用于多型癌症的治疗[1-2]。然而，黄药子临床应用可引起较严重的肝毒性，严重限制了其临床应用和卓有疗效的发挥[3]。另外，实验研究同样显示黄药子能够诱导肝损伤[4]。有研究表明，黄药子的毒性成分主要是二萜内酯类化合物[4-5]。本实验室从黄独中分离得到了其主要的二萜内酯类成分diosbulbin B(DB)。本文主要探讨了DB对小鼠的急性肝毒性，并用ELISA和Western blot方法进一步观察了DB对小鼠血清炎性细胞因子含量和肝重要抗氧化酶HO-1表达的影响。
1材料与方法
, 百拇医药
1.1动物 ICR小鼠，体重18～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物合格证号SCXK(沪)2007-0005。小鼠饲养温度(22±1) ℃，相对湿度(65±10)%，照明时间每天12 h。
1.2药物、试剂与仪器 DB为本实验室从黄药子块茎中分离纯化所得，纯度为98.1%，化学结构见图1。ALT，AST和ALP试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；小鼠血清TNF-α ELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司；小鼠血清IL-4，IL-1β ELISA试剂盒均购自上海丰翔生物科技有限公司；预染的标准蛋白分子购自Fermentas；硝酸纤维素膜购自Bio-Rad公司；HO-1抗体购自Santa Cruz公司；β-actin抗体购自Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔二抗购自Jackson Immuno Research；化学发光检测系统购自Amersham Life Science(英国)。Power Wave XS酶标仪(Bio-Tek公司)；Eppendorf 5415R 低温高速离心机(德国Eppendorf公司)；蛋白电泳仪(美国Bio-Rad公司)；G：BOX Chemi XL1.4化学发光成像系统(SYNGENE公司)；JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。
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1.3动物处理 雄性ICR小鼠，适应性饲养后，按体重随机分为4组，即正常组、DB 低、中、高剂量组(113，150，200 mg·kg-1)，每组8只。禁食12 h后，给予相应剂量的DB，给药体积20 mL·kg-1，其中DB用0.5% CMC-Na溶解至所需浓度，正常组给予等体积的0.5%CMC-Na，24 h后摘眼球采血，并迅速取肝组织用锡箔纸包好，液氮冻存后于-80 ℃冰箱保存，待测相关指标。
1.4血清肝生化指标检测 血液在室温下静置2 h，3 000 r·min-1离心10 min，吸取上层血清分装于Eppendorf管中，保存于-20 ℃。血清中ALT，AST，ALP活性的测定，按照试剂盒说明书的步骤操作。
1.5ELISA 法检测血清中TNF-α，IL-4及IL-1β的含量 严格按照ELISA试剂盒说明书操作，最后用酶标仪测定在450 nm下的吸光度。利用测得的吸光度为纵坐标，相应的标准物的浓度为横坐标建立标准曲线。根据标准曲线和测得的样品吸光度，计算血清各个细胞因子的含量。
1.6Western blot法检测肝组织中HO-1的表达 样品以12% SDS-PAGE胶进行电泳，然后将胶上的蛋白电转移至硝酸纤维素膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1 h后，加入1∶200稀释的HO-1抗体，4 ℃孵育过夜。洗去过量一抗后，加入1∶3 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，室温孵育1 h。用TBST洗去过量二抗后，加入ECL发光液进行曝光，结果用GeneTools图像分析软件定量。
1.7统计学分析 实验数据以±s表示，用SPSS 16.0软件进行统计学分析。多组间比较采用单因素方差分析，两组比较采用独立样本t检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。, 百拇医药(牛成伟 陆宾 季莉莉 王峥涛)
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黄药子为薯蓣科薯蓣属植物黄独Dioscorea bulbifera L.的地下块茎，药性苦寒，具有散结消瘿、清热解毒、凉血止血的作用。临床上除用于甲状腺疾病外，还常将黄药子用于多型癌症的治疗[1-2]。然而，黄药子临床应用可引起较严重的肝毒性，严重限制了其临床应用和卓有疗效的发挥[3]。另外，实验研究同样显示黄药子能够诱导肝损伤[4]。有研究表明，黄药子的毒性成分主要是二萜内酯类化合物[4-5]。本实验室从黄独中分离得到了其主要的二萜内酯类成分diosbulbin B(DB)。本文主要探讨了DB对小鼠的急性肝毒性，并用ELISA和Western blot方法进一步观察了DB对小鼠血清炎性细胞因子含量和肝重要抗氧化酶HO-1表达的影响。
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1.2药物、试剂与仪器 DB为本实验室从黄药子块茎中分离纯化所得，纯度为98.1%，化学结构见图1。ALT，AST和ALP试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；小鼠血清TNF-α ELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司；小鼠血清IL-4，IL-1β ELISA试剂盒均购自上海丰翔生物科技有限公司；预染的标准蛋白分子购自Fermentas；硝酸纤维素膜购自Bio-Rad公司；HO-1抗体购自Santa Cruz公司；β-actin抗体购自Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔二抗购自Jackson Immuno Research；化学发光检测系统购自Amersham Life Science(英国)。Power Wave XS酶标仪(Bio-Tek公司)；Eppendorf 5415R 低温高速离心机(德国Eppendorf公司)；蛋白电泳仪(美国Bio-Rad公司)；G：BOX Chemi XL1.4化学发光成像系统(SYNGENE公司)；JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。
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1.3动物处理 雄性ICR小鼠，适应性饲养后，按体重随机分为4组，即正常组、DB 低、中、高剂量组(113，150，200 mg·kg-1)，每组8只。禁食12 h后，给予相应剂量的DB，给药体积20 mL·kg-1，其中DB用0.5% CMC-Na溶解至所需浓度，正常组给予等体积的0.5%CMC-Na，24 h后摘眼球采血，并迅速取肝组织用锡箔纸包好，液氮冻存后于-80 ℃冰箱保存，待测相关指标。
1.4血清肝生化指标检测 血液在室温下静置2 h，3 000 r·min-1离心10 min，吸取上层血清分装于Eppendorf管中，保存于-20 ℃。血清中ALT，AST，ALP活性的测定，按照试剂盒说明书的步骤操作。
1.5ELISA 法检测血清中TNF-α，IL-4及IL-1β的含量 严格按照ELISA试剂盒说明书操作，最后用酶标仪测定在450 nm下的吸光度。利用测得的吸光度为纵坐标，相应的标准物的浓度为横坐标建立标准曲线。根据标准曲线和测得的样品吸光度，计算血清各个细胞因子的含量。
1.6Western blot法检测肝组织中HO-1的表达 样品以12% SDS-PAGE胶进行电泳，然后将胶上的蛋白电转移至硝酸纤维素膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1 h后，加入1∶200稀释的HO-1抗体，4 ℃孵育过夜。洗去过量一抗后，加入1∶3 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，室温孵育1 h。用TBST洗去过量二抗后，加入ECL发光液进行曝光，结果用GeneTools图像分析软件定量。
1.7统计学分析 实验数据以±s表示，用SPSS 16.0软件进行统计学分析。多组间比较采用单因素方差分析，两组比较采用独立样本t检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。, 百拇医药(牛成伟 陆宾 季莉莉 王峥涛)