丹参转基因毛状根离体培养体系的建立及分析(2)
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参见附件。
1.5 转基因毛状根的GFP鉴定和PCR鉴定
将含毛状根的培养皿放在倒置荧光显微镜下，在蓝色激发光源下观察。
取丹参新鲜叶片和毛状根各0.1 g，用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，纯化后作为PCR扩增模板。根据已发表的序列设计Ri质粒中rolC基因的PCR引物。扩增体系： DNA 50 ng，10×缓冲液(含MgCl2) 2.5 μL，PF和PR 引物(均为10 μmol·L-1) 各0. 5 μL，Taq酶0. 3 μL，dNTP(10 mmol·L-1)2 μL，加水至25 μL。反应条件： 94 ℃预变性4 min； 94 ℃ 变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30 个循环； 72 ℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳分离扩增后产物进行染色分析。以丹参叶片DNA为阴性对照(NC)，以非转基因丹参毛状根作为阳性对照(WT)。
1.6 转基因毛状根生长曲线及丹参酮类物质积累
经过上述筛选的阳性毛状根在长至5 cm后，移入含有2.5 mg·L-1 Hyg的6，7V液体培养基中，25 ℃ 110 r·min-1暗培养。取同一株系生长旺盛的丹参转基因毛状根1 g鲜重(FW)，无菌条件下接种至100 mL三角瓶中(50 mL培养液/瓶)，共计15瓶，从继代培养第20天开始，每隔10 d 取出毛状根在37 ℃培养箱干燥48 h至恒重后测定干重(DW)，每次取3瓶，计算平均值，绘制生长曲线。
精确称取干燥至恒重的毛状根50 mg于2 mL的EP管中，加入两颗甲醇浸泡过夜的磁珠，球磨机研磨45 s，加入1.5 mL MeOH，25 ℃超声45 min，补足体积至2 mL ......
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