HSP70基因转染对人心肌细胞的保护作用
http://www.100md.com
37c医学网
作者：杜亮 郭兰敏 劳萍 王春霞 胡海燕
单位：杜亮 郭兰敏(山东省立医院心外科)；劳萍 王春霞(山东省立医院中心实验室)；胡海燕(山东医科大学分子生物学实验室)
关键词：热休克蛋白70；心肌细胞；转染；细胞保护
山东医科大学学报000224
摘 要：目的：探讨利用热休克蛋白70(HSP70)基因转染技术保护人心肌细胞的可行性。方法：用指质体介导的基因转移技术，研究了外源性HSP70基因高表达对人心肌细胞的保护作用。结果：转染的心肌细胞在正常温度(37℃)下，可高水平表达HSP70，模拟缺血实验后，心肌肌酸激酶(CK-MB)释放量为(159.5±24.1)IU/L几，细胞生存率为(33.78±5.4)%，其抗模拟缺血能力明显高于对照组，而与热休克预处理后24小时组无显著差异。结论：基因转染造成的HSP70高表达可保护人心肌细胞。
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分类号：R456+1.4；R331.3+ 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)02-0179-03
TRANSFECTION OF HEAT SHOCK PROTEIN 70 GENE PROTECTS HUMAN MYOCARDIOCYTES
DU Liang,GUO Lan-min,LAO Ping
(Dept.of Cardiovascular Surgery,Shandong Provincial Hospital)
Abstract：Objective:To study the feasibility of protecting human myocardiocytes with liposome-mediated heat shock protein 70 (HSP70)gene transfection.Methods:The cultured human myocardiocytes were transfected by HSP70 gene with liposome-mediated transfection,and the effect of HSP70 overexpression was studied.Results:The transfected myocardiocytes overexpressed HSP70 at normal temperature(37℃).After simulated ischemia,the release of CK-MB was(159.5±24.1) IU/L and the ecll viability was (33.78±5.4)%.While the resistance of transfected cells to simulated ischemia was significantly higher than that of the controls,there was not much difference in resistance to simulated ischemia between transfected and heat-shocked cells.Conclusion:The overexpression of HSP70 induced by liposome-mediated transfection could protect human myocardiocytes.
, 百拇医药
Keywords：Heat shock protein70;Myocardiocyte;Transfection;Cytoprotection 近年来发现，实验动物经热休克预处理后，其心肌中热休克蛋白70(HSP70)含量上升，对缺血再灌注的拮抗能力明显提高[1]。目前国内外正在积极研究利用HSP70保护人类心肌，但是提高HSP70表达水平的方法及其对人类心肌的作用尚无定论。我们利用脂质体介导的基因转移技术，将携带人HSP70基因的真核表达载体导入体外培养的人心肌细胞中，观察HSP70高表达对人心肌细胞的作用。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1质粒质粒pβac-nec-HSP70由美国西北大学的SueFox教授惠赠，其中含有人HSP70基因的全长cDNA，质粒pHβApr-l-neo是与之对应的空载真核表达载体。
, 百拇医药
1.1.2主要试剂脂质体(DOTAP)、G418和地高辛标记及检测试剂盒购自BoehringerMannheim公司。HSP70单抗、肌红蛋白(Myoglobin)单抗、BamHⅠ内切酶、DNA和蛋白质分子量标准购自Sigma公司。DMEM培养基为Gibco公司产品。
1.2方法
1.2.1细胞培养和鉴定取12～16周流产胎儿，无菌剪取心室肌，剥除心内、外膜，用文献[2]的消化法培养心肌细胞。培养基为含10%胎牛血清的DMEM，培养条件为37℃，5%CO2。取3代以内处于对数生长期的细胞用于实验，并用肌红蛋白单抗进行免疫组化染色(SABC法)鉴定。
1.2.2质粒操作将两质粒扩增、提取并纯化。BamHⅠ酶切鉴定质粒pβac-neo-HSP70，回收片断。
1.2.3HSP70探针的标记按地高辛标记及检测试剂盒的说明操作。
, 百拇医药
1.2.4心肌细胞转染按DOTAP试剂说明操作。事先确定心肌细胞的G418筛选浓度。接种细胞于60mm培养皿中，生长至50%汇合后，以DOTAP分别包裹两质粒转染上述细胞10h，然后换含筛选浓度G418的培养液，并设未进行转染的细胞为阴性对照，培养10～14d后，加转染液的培养皿中有极少数细胞存活，换常规培养液继续培养，获得细胞Th(转染HSP70)和细胞Tc(转染空载质粒)。
1.2.5热休克预处理密封培养器皿，在43℃的水浴中加热30min后，继续培养0、24和48h，获得细胞H0、H24和H48用于实验。
1.2.6原位杂交和Westernblot4%多聚甲醛固定24孔板中的Th、Tc、H0、H24、H48和阴性对照细胞(Nc)，按地高辛标记及检测试剂盒的说明书进行原位杂交，另外收集上述细胞各2×106个，经SDSPAGE、转膜和抗原抗体反应进行Westernblot，并扫描所得条带(岛津CS-930薄层层析色谱仪日本)。
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1.2.7模拟缺血实验以每孔2×103个细胞的密度，将Th、Tc和Nc接种于96孔板，部分Nc细胞进行热休克预处理，获得H0、H24和H48细胞。待上述细胞生长至80%汇合后，将培养液换为每孔200μlPBS，置培养板于充有纯氮气的密闭容器中，3h后吸取上层PBS，测心肌肌酸激酶(CK-MB)含量(BeckmanCX-4型全自动生化分析仪美国)，下层细胞进行MTT实验，测量吸光度(A)，计算细胞存活率的公式为：存活率(%)＝(缺血实验后的A值/阴性对照的A值)×100
2结果
2.1心肌细胞培养经肌红蛋白单抗免疫组化染色鉴定，培养细胞着色阳性率大于95%，并观察到原代的细胞有搏动现象，证实为高纯度的人心肌细胞。
2.2质粒操作BamHⅠ酶切质粒pβac-neo-HSP70后，出现2.4kb的片段，即人HSP70CDNA，琼脂糖电泳结果见图1。
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图1质粒pβac-neo-HSP70酶切鉴定的琼脂糖电泳
Fig.1RestrictionendonucleaseBamHⅠanalysisofplasmidpβac-neo-HSP70throughagarosegel
1:Marker;2:pβac-neo-HSP70(BamHⅠanalysis);3:pβac-neo-HSP70
2.3转染心肌细胞的G418筛选浓度为500mg/L，经上述浓度筛选10～14d后，未加转染液的细胞全部死亡，加转染液的细胞中有极少数存活，换常规培养液，扩增所获细胞克隆，分别得到细胞Th和Tc。
2.4原位杂交Th细胞的胞质中和近胞膜处有大量棕黄色颗粒沉着(见图2)，说明HSP70基因已转入并明显表达。Tc和Nc细胞仅有极低水平的表达。热休克预处理的细胞中，H0表达水平最高，H24次之，H48的表达水平近似Tc和Nc。
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图2转染的心肌细胞Th的HSP70mRNA原位杂交(×200)
Fig.2InsituhybridizationofHSP70mRNAintransfectedmyocardiocytesTh(×200)
2.5Westernblot显示在分子量70kd的位置附近，Th和H24细胞均出现一条棕褐色条带，而其他细胞的条带比较浅淡，见图3。图4是薄层扫描所得各组(n＝3)峰面积积分值，Th为2870，4±267.6，与H24无显著差异，明显高于其他组。
图3Westernblot显示各组心肌细胞HSP70的含量
Fig.3WesternblotanalysisofHSP70ineachgroupsofmyocardiocrtes
图4Westernblot条带光密度扫描
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Fig.4SpectrophotometricanalysisofWesternblot
*P<0.05vsNc
2.6模拟缺血实验结果见图5和图6，Th的CKMB漏出量为(159.5±24.1)IU/L，生存率为(33.78+5.4)%，与H24无显著差异，明显优于其他组。
图5模拟缺血实验后各组心肌肌酸激酶(CK-MB)释放量
Fig.5ReleaseofCK-MBineachgroupsaftersimulatedischemia
*P<0.05vsNc
图6模拟缺血实验后各组心肌细胞的生存率
Fig-6Viabilityaftersimulatedischemia
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*P<0.05vsNc
3讨论
热休克蛋白(HSP)存在于一切生物细胞，正常情况下其表达水平较低，受到亚致死剂量的热应激及其他有害因素(如缺血、缺氧、乙醇、重金属盐和感染等)的刺激后，表达增多，并使细胞获得抵抗更严重的上述应激的能力，HSP中分子量为70kd的HSP70含量最高，研究也最多[1]。研究证实，热休克反应(HSR)中，心肌细胞HSP70基因的转录水平提高，HSP70表达增多，伴随着心肌细胞抗缺血能力的增强[1][3]，并发现HSP70诱导的数量与保护作用的强弱呈正相关[4]，但由于HSR中还伴随着其他分子量的HSP和过氧化氢酶等保护物质的增多，故上述研究仅能表明HSP70与心肌保护之间关系密切。最近发现，HSP70转基因鼠的心肌抗缺血再灌损伤能力显著提高，直接证明了HSP70的心肌保护作用[5]。既然心肌对缺血的拮抗是通过合成HSP70来实现的，那么提高心肌细胞HSP7O含量有助于保护心肌。由于临床心肌保护尚未完善，利用增加HSP70含量的方法来保护心肌，具有现实意义。
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目前，提高心肌细胞HSP70含量的方法有两类：诱导内源性HSP70的表达和导入外源性HSP70基因。热休克预处理是诱导内源性HSP70表达的经典方法，我们发现人的心肌细胞经热休克后，其HSP70的表达和保护作用存在最佳时间范围，24小时后达高峰，48小时后基本恢复到处理前的状态，这与1993年Currie等[3]对兔心的研究结果相近，说明热休克预处理对人心肌的保护存在一个绝对恢复期，且超过一定时限就失去作用。利用分子生物学技术，将外源性HSP70基因导入心肌细胞中，提高HSP70基因的表达水平，也可保护心肌。我们发现基因转染对人心肌细胞的保护作用有以下特点：①无需应激的刺激，也不存在应激的损伤；②表达稳定，不存在绝对恢复期和有效时间的限制；③其保护强度与热休克预处理相近；④对心肌细胞无不良作用。
利用HSP70基因转染获得的心肌保护效果与热休克预处理无明显差异，表明外源HSP70基因表达可起到保护作用，反之也证明HSP70是热休克预处理中起主要作用的因子。传统预处理保护作用时限短，处理措施本身对心肌有损伤，且临床难以施行。利用基因转移的方法促使HSP70基因的高表达，克服了上述缺陷，有广阔的应用前景。
, 百拇医药
参考文献：
[1]Wiliams RS.Heat shock proteins and ischemic injury to the myocardium[J].Circulation,1997,96:4138
[2]Arstall MA,Zhao YZ,Hornberger L,et al.Human ventricular myocytes in vitro exhibit both early and delayed preconditioning responses to simulated ischemia[J].J Mol Cell Cardiol,1998,30:1019
[3]Currie RW,Tanguay RM,Kingma JG,et al.Heat-shock response and limitation of tissue necrosis during occlusion/reperfusion in rabbit hearts[J].Circulation,1993,87:963
, 百拇医药
[4]Hutter MM,Sievers RE,Barbosa V,et al.Heat-shock protein induction in rat hearts:a direct correlation between the amount of heat-shock protein induced and the degree of myocardial protection[J].Circulation,1994,89:355
[5]Radford NB,Fina M,Benjamin IJ,et al.Cardioprotective effects of 70-kDa heat shock protein in transgenic mice[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:2339
收稿日期：1999-09-01, 百拇医药
单位：杜亮 郭兰敏(山东省立医院心外科)；劳萍 王春霞(山东省立医院中心实验室)；胡海燕(山东医科大学分子生物学实验室)
关键词：热休克蛋白70；心肌细胞；转染；细胞保护
山东医科大学学报000224
摘 要：目的：探讨利用热休克蛋白70(HSP70)基因转染技术保护人心肌细胞的可行性。方法：用指质体介导的基因转移技术，研究了外源性HSP70基因高表达对人心肌细胞的保护作用。结果：转染的心肌细胞在正常温度(37℃)下，可高水平表达HSP70，模拟缺血实验后，心肌肌酸激酶(CK-MB)释放量为(159.5±24.1)IU/L几，细胞生存率为(33.78±5.4)%，其抗模拟缺血能力明显高于对照组，而与热休克预处理后24小时组无显著差异。结论：基因转染造成的HSP70高表达可保护人心肌细胞。
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分类号：R456+1.4；R331.3+ 文献标识码：A
文章编号：1000-0496(2000)02-0179-03
TRANSFECTION OF HEAT SHOCK PROTEIN 70 GENE PROTECTS HUMAN MYOCARDIOCYTES
DU Liang,GUO Lan-min,LAO Ping
(Dept.of Cardiovascular Surgery,Shandong Provincial Hospital)
Abstract：Objective:To study the feasibility of protecting human myocardiocytes with liposome-mediated heat shock protein 70 (HSP70)gene transfection.Methods:The cultured human myocardiocytes were transfected by HSP70 gene with liposome-mediated transfection,and the effect of HSP70 overexpression was studied.Results:The transfected myocardiocytes overexpressed HSP70 at normal temperature(37℃).After simulated ischemia,the release of CK-MB was(159.5±24.1) IU/L and the ecll viability was (33.78±5.4)%.While the resistance of transfected cells to simulated ischemia was significantly higher than that of the controls,there was not much difference in resistance to simulated ischemia between transfected and heat-shocked cells.Conclusion:The overexpression of HSP70 induced by liposome-mediated transfection could protect human myocardiocytes.
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Keywords：Heat shock protein70;Myocardiocyte;Transfection;Cytoprotection 近年来发现，实验动物经热休克预处理后，其心肌中热休克蛋白70(HSP70)含量上升，对缺血再灌注的拮抗能力明显提高[1]。目前国内外正在积极研究利用HSP70保护人类心肌，但是提高HSP70表达水平的方法及其对人类心肌的作用尚无定论。我们利用脂质体介导的基因转移技术，将携带人HSP70基因的真核表达载体导入体外培养的人心肌细胞中，观察HSP70高表达对人心肌细胞的作用。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1质粒质粒pβac-nec-HSP70由美国西北大学的SueFox教授惠赠，其中含有人HSP70基因的全长cDNA，质粒pHβApr-l-neo是与之对应的空载真核表达载体。
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1.1.2主要试剂脂质体(DOTAP)、G418和地高辛标记及检测试剂盒购自BoehringerMannheim公司。HSP70单抗、肌红蛋白(Myoglobin)单抗、BamHⅠ内切酶、DNA和蛋白质分子量标准购自Sigma公司。DMEM培养基为Gibco公司产品。
1.2方法
1.2.1细胞培养和鉴定取12～16周流产胎儿，无菌剪取心室肌，剥除心内、外膜，用文献[2]的消化法培养心肌细胞。培养基为含10%胎牛血清的DMEM，培养条件为37℃，5%CO2。取3代以内处于对数生长期的细胞用于实验，并用肌红蛋白单抗进行免疫组化染色(SABC法)鉴定。
1.2.2质粒操作将两质粒扩增、提取并纯化。BamHⅠ酶切鉴定质粒pβac-neo-HSP70，回收片断。
1.2.3HSP70探针的标记按地高辛标记及检测试剂盒的说明操作。
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1.2.4心肌细胞转染按DOTAP试剂说明操作。事先确定心肌细胞的G418筛选浓度。接种细胞于60mm培养皿中，生长至50%汇合后，以DOTAP分别包裹两质粒转染上述细胞10h，然后换含筛选浓度G418的培养液，并设未进行转染的细胞为阴性对照，培养10～14d后，加转染液的培养皿中有极少数细胞存活，换常规培养液继续培养，获得细胞Th(转染HSP70)和细胞Tc(转染空载质粒)。
1.2.5热休克预处理密封培养器皿，在43℃的水浴中加热30min后，继续培养0、24和48h，获得细胞H0、H24和H48用于实验。
1.2.6原位杂交和Westernblot4%多聚甲醛固定24孔板中的Th、Tc、H0、H24、H48和阴性对照细胞(Nc)，按地高辛标记及检测试剂盒的说明书进行原位杂交，另外收集上述细胞各2×106个，经SDSPAGE、转膜和抗原抗体反应进行Westernblot，并扫描所得条带(岛津CS-930薄层层析色谱仪日本)。
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1.2.7模拟缺血实验以每孔2×103个细胞的密度，将Th、Tc和Nc接种于96孔板，部分Nc细胞进行热休克预处理，获得H0、H24和H48细胞。待上述细胞生长至80%汇合后，将培养液换为每孔200μlPBS，置培养板于充有纯氮气的密闭容器中，3h后吸取上层PBS，测心肌肌酸激酶(CK-MB)含量(BeckmanCX-4型全自动生化分析仪美国)，下层细胞进行MTT实验，测量吸光度(A)，计算细胞存活率的公式为：存活率(%)＝(缺血实验后的A值/阴性对照的A值)×100
2结果
2.1心肌细胞培养经肌红蛋白单抗免疫组化染色鉴定，培养细胞着色阳性率大于95%，并观察到原代的细胞有搏动现象，证实为高纯度的人心肌细胞。
2.2质粒操作BamHⅠ酶切质粒pβac-neo-HSP70后，出现2.4kb的片段，即人HSP70CDNA，琼脂糖电泳结果见图1。
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图1质粒pβac-neo-HSP70酶切鉴定的琼脂糖电泳
Fig.1RestrictionendonucleaseBamHⅠanalysisofplasmidpβac-neo-HSP70throughagarosegel
1:Marker;2:pβac-neo-HSP70(BamHⅠanalysis);3:pβac-neo-HSP70
2.3转染心肌细胞的G418筛选浓度为500mg/L，经上述浓度筛选10～14d后，未加转染液的细胞全部死亡，加转染液的细胞中有极少数存活，换常规培养液，扩增所获细胞克隆，分别得到细胞Th和Tc。
2.4原位杂交Th细胞的胞质中和近胞膜处有大量棕黄色颗粒沉着(见图2)，说明HSP70基因已转入并明显表达。Tc和Nc细胞仅有极低水平的表达。热休克预处理的细胞中，H0表达水平最高，H24次之，H48的表达水平近似Tc和Nc。
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图2转染的心肌细胞Th的HSP70mRNA原位杂交(×200)
Fig.2InsituhybridizationofHSP70mRNAintransfectedmyocardiocytesTh(×200)
2.5Westernblot显示在分子量70kd的位置附近，Th和H24细胞均出现一条棕褐色条带，而其他细胞的条带比较浅淡，见图3。图4是薄层扫描所得各组(n＝3)峰面积积分值，Th为2870，4±267.6，与H24无显著差异，明显高于其他组。
图3Westernblot显示各组心肌细胞HSP70的含量
Fig.3WesternblotanalysisofHSP70ineachgroupsofmyocardiocrtes
图4Westernblot条带光密度扫描
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Fig.4SpectrophotometricanalysisofWesternblot
*P<0.05vsNc
2.6模拟缺血实验结果见图5和图6，Th的CKMB漏出量为(159.5±24.1)IU/L，生存率为(33.78+5.4)%，与H24无显著差异，明显优于其他组。
图5模拟缺血实验后各组心肌肌酸激酶(CK-MB)释放量
Fig.5ReleaseofCK-MBineachgroupsaftersimulatedischemia
*P<0.05vsNc
图6模拟缺血实验后各组心肌细胞的生存率
Fig-6Viabilityaftersimulatedischemia
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*P<0.05vsNc
3讨论
热休克蛋白(HSP)存在于一切生物细胞，正常情况下其表达水平较低，受到亚致死剂量的热应激及其他有害因素(如缺血、缺氧、乙醇、重金属盐和感染等)的刺激后，表达增多，并使细胞获得抵抗更严重的上述应激的能力，HSP中分子量为70kd的HSP70含量最高，研究也最多[1]。研究证实，热休克反应(HSR)中，心肌细胞HSP70基因的转录水平提高，HSP70表达增多，伴随着心肌细胞抗缺血能力的增强[1][3]，并发现HSP70诱导的数量与保护作用的强弱呈正相关[4]，但由于HSR中还伴随着其他分子量的HSP和过氧化氢酶等保护物质的增多，故上述研究仅能表明HSP70与心肌保护之间关系密切。最近发现，HSP70转基因鼠的心肌抗缺血再灌损伤能力显著提高，直接证明了HSP70的心肌保护作用[5]。既然心肌对缺血的拮抗是通过合成HSP70来实现的，那么提高心肌细胞HSP7O含量有助于保护心肌。由于临床心肌保护尚未完善，利用增加HSP70含量的方法来保护心肌，具有现实意义。
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目前，提高心肌细胞HSP70含量的方法有两类：诱导内源性HSP70的表达和导入外源性HSP70基因。热休克预处理是诱导内源性HSP70表达的经典方法，我们发现人的心肌细胞经热休克后，其HSP70的表达和保护作用存在最佳时间范围，24小时后达高峰，48小时后基本恢复到处理前的状态，这与1993年Currie等[3]对兔心的研究结果相近，说明热休克预处理对人心肌的保护存在一个绝对恢复期，且超过一定时限就失去作用。利用分子生物学技术，将外源性HSP70基因导入心肌细胞中，提高HSP70基因的表达水平，也可保护心肌。我们发现基因转染对人心肌细胞的保护作用有以下特点：①无需应激的刺激，也不存在应激的损伤；②表达稳定，不存在绝对恢复期和有效时间的限制；③其保护强度与热休克预处理相近；④对心肌细胞无不良作用。
利用HSP70基因转染获得的心肌保护效果与热休克预处理无明显差异，表明外源HSP70基因表达可起到保护作用，反之也证明HSP70是热休克预处理中起主要作用的因子。传统预处理保护作用时限短，处理措施本身对心肌有损伤，且临床难以施行。利用基因转移的方法促使HSP70基因的高表达，克服了上述缺陷，有广阔的应用前景。
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[1]Wiliams RS.Heat shock proteins and ischemic injury to the myocardium[J].Circulation,1997,96:4138
[2]Arstall MA,Zhao YZ,Hornberger L,et al.Human ventricular myocytes in vitro exhibit both early and delayed preconditioning responses to simulated ischemia[J].J Mol Cell Cardiol,1998,30:1019
[3]Currie RW,Tanguay RM,Kingma JG,et al.Heat-shock response and limitation of tissue necrosis during occlusion/reperfusion in rabbit hearts[J].Circulation,1993,87:963
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[4]Hutter MM,Sievers RE,Barbosa V,et al.Heat-shock protein induction in rat hearts:a direct correlation between the amount of heat-shock protein induced and the degree of myocardial protection[J].Circulation,1994,89:355
[5]Radford NB,Fina M,Benjamin IJ,et al.Cardioprotective effects of 70-kDa heat shock protein in transgenic mice[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:2339
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