低分子肝素治疗大鼠系膜增殖性肾小球肾炎
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37c医学网
作者：夏志银 马玉华 蒋季杰 钱桐荪 黄丽君
单位：(226001 南通医学院附属医院肾内科)
关键词：低分子肝素；免疫组化；系膜增殖性肾小球肾炎
江苏医药001014 【摘要】 目的 观察低分子肝素对系膜增殖性肾小球肾炎的治疗作用。方法 用抗鼠类胸腺细胞表面的糖蛋白抗原(Thy1.1)单克隆抗体1-22-3诱导Wistar大鼠系膜增殖性肾小球肾炎，用低分子肝素或低分子肝素加地塞米松治疗，通过免疫组化、透射电镜和常规病理染色，观察肾小球内细胞总数、增殖细胞核抗原(PCNA)、肾小球系膜基质以及蛋白尿排泄动力学改变。结果 低分子肝素可降低肾小球内细胞总数和减少肾小球内增殖细胞的数量，抑制系膜基质的增生和减轻尿蛋白的排泄。结论 低分子肝素可治疗系膜增殖性肾小球肾炎。
Low molecular heparin treated rat in mesangioproliferative glomerular nephritis
, http://www.100md.com
XIA Zhiyin MA Yuhua JIANG Jijie et al.
(Department of Nephrology，the Affiliated Hospital of Nantong Medical College，Nantong 226001)
【Abstract】 Objective In order to investigate the effect of low molecular heparin on rats in mesangioproliferative glomerular nephritis.Methods Wistar rat models of mesangioproliferative glomerular nephritis were induced by a single injection of anti-thyl1.1 Moab1-22-3.They received low molecular heparin(LMH) and LMH+DXM treatment.The total glomerular cell numbers，PCNA(+) cells and twenty four hour protein excretion were observed by immonohistochemistry，electon microscopy and light microscopy.Results Low molecular heparin decreased total glomerular cell numbers and protein excretion，and suppressed mesangial cell and matrix proliferation.Conclusion The results suggest that low molecular heparin may treat mesangioproliferative glomerular nephritis.
, 百拇医药
【Key words】 Low molecular heparin Mesangioproliferative glomerular nephritis Immunohistochemicl staining
临床上，弥漫增殖性肾小球肾炎、膜增殖性肾小球肾炎、糖尿病肾病，溶血尿毒素综合征等疾病中，肾小球均有系膜细胞及基质增生现象。作者应用抗Thy1.1的单克隆抗体1-22-3(MoAb 1-22-3)，单次静脉注射Wistar大鼠诱导系膜增殖性肾小球肾炎的动物模型[1]，再用低分子肝素(肝素)治疗，观察肝素对肾小球内系膜细胞及其基质增殖的影响。
材料与方法
一、实验动物
Wistar雄性大鼠(180～200g)共56只，购于上海市动物中心。大鼠随机分四组 正常对照2只；实验对照(N)组18只；肝素治疗(A)组及低分子肝素加地塞米松治疗(B)组各18只。
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二、试剂及方法
1.MoAb 1-22-3由日本Niigata大学肾脏病研究中心提供，完全氟氏佐剂FITC-IgG购于上海华美生物工程公司；PCNA购于北京中山生物技术有限公司，SP试剂盒购于美国ZYMED公司，显色剂DAB购于福州迈新生物技术开发公司，低分子肝素购于合肥兆峰科大药业有限公司。
2.Wistar大鼠的预免疫与系膜增殖性肾小球肾炎动物模型的建立及SP免疫组化染色法参见参考文献[1]。透射电镜观察由南通医学院电镜室完成。腹腔注射肝素及肝素加地塞米松后按1，2，3，4，5，6，7，9，11，13，15天收集24小时尿液，定量测尿蛋白用双缩脲法。
3.大鼠舌下静脉注射MoAb 1-22-3前2天，将各组动物编号后置于代谢笼中，收取24小时尿液。舌下静脉注射MoAb 1-22-3第2天，A、B、N 3组各随机取6只大鼠，用10%水合氯醛(0.4ml/只)，麻醉后用预冷0.01M PBS，腹腔动脉灌注，双侧肾脏变白后处死大鼠，取皮质分别固定于10%中性甲醛、4%戊二醛，用于做HE、PAS、SP染色及电镜检查。同时各组剩余12只大鼠进行腹腔注射：N组0.9%氯化钠溶液1ml；A组每日低分子肝素300±10U/100g，溶于0.9%氯化钠溶液1ml；B组每日低分子肝素300±10U/100g+地塞米松0.5mg/100g溶解于1ml 0.9%氯化钠溶液中。连续腹腔注射3天。第6天3组各随机取6只大鼠，用上述方法麻醉取肾，固定肾皮质做病理检查。第15天各组剩余6只大鼠按上述方法麻醉取肾，固定肾皮质做病理检查。计数肾小球内增生细胞数和细胞总数时用双盲法，选直径为80～100μm，平均数为20个肾小球，但多形核以及一些退变细胞核的碎片除外。
, 百拇医药
4.所有数据值均用
±s表示，应用Poisson分布检验处理肾小球细胞数间比较，对24小时尿蛋白应用曲线拟合方法，24小时尿蛋白变化趋势曲线方程为y＝C1×eC2｜t-C4｜+C3(t-C4)(C1为最大值的估计值，C4为达到最大值的时间，C3-C2表示在达到最大值之前的增加速度，C3+C2表示在达到最大值之后的下降速度)。
结果
一、肾小球内细胞总数及增殖细胞数各组比较
肾小球内细胞外基质观察，从病理切片染色及透射电镜照片上来看，肝素及肝素加地塞米松组治疗后细胞外基质明显减少(见表1，N、A、B右下角码为各组治疗天数)。
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表1 低分子肝素治疗系膜增殖性肾小球肾炎大鼠对
肾小球内增生细胞及肾小球内总细胞数的影响(±s) 组别
鼠数
(只)
检测
肾小球数
肾小球内PCNA(+)
细胞平均数
肾小球平均
细胞总数
正常大鼠
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2
20
1.02±0.78a
69.35±0.21a
N2
6
20
4.69±1.23b
43.50±2.32b
A2
6
, 百拇医药
20
5.37±1.35b
42.07±3.03b
B2
6
20
4.53±2.01b
45.56±1.98b
N6
6
20
, 百拇医药
16.23±1.32c
90.50±3.27c
A6
6
20
10.97±0.98d
83.50±2.08d
B6
6
20
7.01±2.13d
, 百拇医药
82.30±1.47d
注：数字上方字母相同者，无显著性差异(P>0.05)，数字不同者，有显著性差异(P<0.05)。
二、24小时尿蛋白排出动力学变化结果
A组、B组与N组比较，其尿蛋白的高峰值均下降，且统计学检验有显著差异，P值均<0.01，见图1。而达到最大值的时间B组较A组早，差异显著(P<0.01)，B组、A组达到最大值的时间均较N组早，差异显著(P<0.01)，3组尿蛋白变化趋势特征比较见表2。讨论
大鼠舌下静脉注射抗Thy1.1MoAb1-22-3，能稳定建立系膜增殖性肾小球肾炎的动物模型[1]。在体外，系膜细胞对抗凝血肝素非常敏感[2]。VanBruggen等研究发现给MRL/LPr小鼠输注肝素可延缓小鼠肾炎的进展[3]。本实验观察了应用低分子肝素后肾小球内细胞数明显减少，而且PCNA阳性的细胞数也明显的减少，提示肝素能抑制肾小球内系膜细胞的增殖。作用机制可能为肝素抑制细胞生长在G1后期及G1-S间期。其抗增殖作用是肝素分子中的5～6个糖基上氧的硫酸化。从病理改变中来看，肾小球中基质明显减少，提示肝素能抑制系膜细胞外基质成份的增加。Floege研究发现肝素能减少纤维细胞生长因子(bFGF)的表达，抑制层连蛋白(Laminin)，Ⅰ型、Ⅳ型胶原蛋白和纤维连接蛋白等合成，从而抑制系膜及基质增生而阻止肾小球的硬化[4]。
, 百拇医药
时间(天)
图1 低分子肝素和低分子肝素加地塞米松治疗系膜增生性
肾小球肾炎大鼠对24小时尿蛋白的影响
表2 三组尿蛋白变化趋势特征比较(±s)
N组
A组
B组
Max
164.96±18.27
112.50±12.87
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115.96±13.55
tmax
5.65±0.32
4.84±0.36
4.41±0.36△
tmax之前增加速度
0.49±0.08
0.49±0.08
0.41±0.07
tmax之后下降速度
, 百拇医药
-0.27±0.08
-0.28±0.08
0.23±0.07
与N组比，P<0.01，与A组比较，△P<0.01。
本组也观察了肝素和地塞米松的联合治疗作用。肾上腺皮质激素的作用一般认为，主要是对单核巨噬细胞和T淋巴细胞的抑制效应，抑制单核巨噬细胞产生IL-2及Fc段和C3受体的表达，激活的T细胞产生的淋巴因子如IL-2、γ干扰素、IL-6均受抑制。与肝素联合应用，抗炎抗增生作用更强，但从肾小球内细胞总数和增殖细胞数以及尿蛋白排泄动力学改变几个方面来看，其效果并不优于单独肝素治疗组。这与Ando等报道不一致，Ando等研究认为肾上腺糖皮质激素和肝素联合治疗后Caldesmon蛋白表达受抑制，肾炎减轻[5]。至于结果不一致的原因，还有待进一步的研究探讨。
, 百拇医药
肝素对尿蛋白排泄动力学的影响，本研究发现肝素能减少尿蛋白的排出，提前尿蛋白的排泄峰值到达，且肝素加地塞米松组尤为明显，也提示地塞米松可加快尿蛋白排泄，但对尿蛋白排泄量的影响不大，其机制还待探讨。Kramers等研究发现，组蛋白可介导与DNA组合的抗DNA抗体与肾小球基底膜上的硫酸类肝素结合。给SLE小鼠体内输入小量肝素，结合抗DNA-CIC，阻断它们与肾小球基底膜结合减轻肾损害[6]，从而减少尿蛋白的排出，但肝素对尿蛋白影响确切机制还有待深入研究。
总之，腹腔注射肝素可抑制大鼠系膜增殖性肾小球肾炎模型中肾小球细胞增殖及肾小球内细胞外基质增加。肾上腺皮质激素与肝素联合使用，并不优于单独使用肝素治疗，机制有待进一步研究。
参考文献
1，夏志银，钱桐荪，蒋季杰，等.单克隆抗体1-22-3诱导大鼠系膜增殖性小肾炎动物模型研究.南通医学院学报，1997，17：468-470.
, 百拇医药
2，Guyton JR，Rosenberg RD，Clowes AW，et al.Inhibition of rat raterial smooth muscle cell proliferation by heparin.Circ Res，1980，46：625-634.
3，Van Bruggen MC，Walgreen B，Rijke TP，et al.Heparin and heparinoids prevent the binding of immune complexes containing nucleosomal antigens to the GBM and delay nephritis in MRL/LPr mice.Kidney International，1996，50：1555-1564.
4，Floege J，Eng E，Uoung BA，et al.Heparin suppresses mesangial cell proliferation and matrix expansion in experimental mesangioproliferation glomerulonephritis.Kidney International，1993，43：269-280.
, 百拇医药
5，Ando Y，Mori Yama T，Miyazaki，et al.Enhanced glomerular expression of caldesmon in IgA nephropathy and its suppression by glucocorticoid-heparin therapy.Nephrol Dial Transplant，1998，13：1168-1175.
6，Kramers C，HyLKema MN，VanBruggen MC，et al.Anti-nucleosome antibodies complexed to nucle osomal antigens show anti-DNA reactivity and bind to rat glomerular basement membrane in vivo.Journal of clinicl Investigation，1994，94：568-577.
收稿：1999-09-02
修回：2000-04-17, 百拇医药
单位：(226001 南通医学院附属医院肾内科)
关键词：低分子肝素；免疫组化；系膜增殖性肾小球肾炎
江苏医药001014 【摘要】 目的 观察低分子肝素对系膜增殖性肾小球肾炎的治疗作用。方法 用抗鼠类胸腺细胞表面的糖蛋白抗原(Thy1.1)单克隆抗体1-22-3诱导Wistar大鼠系膜增殖性肾小球肾炎，用低分子肝素或低分子肝素加地塞米松治疗，通过免疫组化、透射电镜和常规病理染色，观察肾小球内细胞总数、增殖细胞核抗原(PCNA)、肾小球系膜基质以及蛋白尿排泄动力学改变。结果 低分子肝素可降低肾小球内细胞总数和减少肾小球内增殖细胞的数量，抑制系膜基质的增生和减轻尿蛋白的排泄。结论 低分子肝素可治疗系膜增殖性肾小球肾炎。
Low molecular heparin treated rat in mesangioproliferative glomerular nephritis
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XIA Zhiyin MA Yuhua JIANG Jijie et al.
(Department of Nephrology，the Affiliated Hospital of Nantong Medical College，Nantong 226001)
【Abstract】 Objective In order to investigate the effect of low molecular heparin on rats in mesangioproliferative glomerular nephritis.Methods Wistar rat models of mesangioproliferative glomerular nephritis were induced by a single injection of anti-thyl1.1 Moab1-22-3.They received low molecular heparin(LMH) and LMH+DXM treatment.The total glomerular cell numbers，PCNA(+) cells and twenty four hour protein excretion were observed by immonohistochemistry，electon microscopy and light microscopy.Results Low molecular heparin decreased total glomerular cell numbers and protein excretion，and suppressed mesangial cell and matrix proliferation.Conclusion The results suggest that low molecular heparin may treat mesangioproliferative glomerular nephritis.
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【Key words】 Low molecular heparin Mesangioproliferative glomerular nephritis Immunohistochemicl staining
临床上，弥漫增殖性肾小球肾炎、膜增殖性肾小球肾炎、糖尿病肾病，溶血尿毒素综合征等疾病中，肾小球均有系膜细胞及基质增生现象。作者应用抗Thy1.1的单克隆抗体1-22-3(MoAb 1-22-3)，单次静脉注射Wistar大鼠诱导系膜增殖性肾小球肾炎的动物模型[1]，再用低分子肝素(肝素)治疗，观察肝素对肾小球内系膜细胞及其基质增殖的影响。
材料与方法
一、实验动物
Wistar雄性大鼠(180～200g)共56只，购于上海市动物中心。大鼠随机分四组 正常对照2只；实验对照(N)组18只；肝素治疗(A)组及低分子肝素加地塞米松治疗(B)组各18只。
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二、试剂及方法
1.MoAb 1-22-3由日本Niigata大学肾脏病研究中心提供，完全氟氏佐剂FITC-IgG购于上海华美生物工程公司；PCNA购于北京中山生物技术有限公司，SP试剂盒购于美国ZYMED公司，显色剂DAB购于福州迈新生物技术开发公司，低分子肝素购于合肥兆峰科大药业有限公司。
2.Wistar大鼠的预免疫与系膜增殖性肾小球肾炎动物模型的建立及SP免疫组化染色法参见参考文献[1]。透射电镜观察由南通医学院电镜室完成。腹腔注射肝素及肝素加地塞米松后按1，2，3，4，5，6，7，9，11，13，15天收集24小时尿液，定量测尿蛋白用双缩脲法。
3.大鼠舌下静脉注射MoAb 1-22-3前2天，将各组动物编号后置于代谢笼中，收取24小时尿液。舌下静脉注射MoAb 1-22-3第2天，A、B、N 3组各随机取6只大鼠，用10%水合氯醛(0.4ml/只)，麻醉后用预冷0.01M PBS，腹腔动脉灌注，双侧肾脏变白后处死大鼠，取皮质分别固定于10%中性甲醛、4%戊二醛，用于做HE、PAS、SP染色及电镜检查。同时各组剩余12只大鼠进行腹腔注射：N组0.9%氯化钠溶液1ml；A组每日低分子肝素300±10U/100g，溶于0.9%氯化钠溶液1ml；B组每日低分子肝素300±10U/100g+地塞米松0.5mg/100g溶解于1ml 0.9%氯化钠溶液中。连续腹腔注射3天。第6天3组各随机取6只大鼠，用上述方法麻醉取肾，固定肾皮质做病理检查。第15天各组剩余6只大鼠按上述方法麻醉取肾，固定肾皮质做病理检查。计数肾小球内增生细胞数和细胞总数时用双盲法，选直径为80～100μm，平均数为20个肾小球，但多形核以及一些退变细胞核的碎片除外。
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4.所有数据值均用
±s表示，应用Poisson分布检验处理肾小球细胞数间比较，对24小时尿蛋白应用曲线拟合方法，24小时尿蛋白变化趋势曲线方程为y＝C1×eC2｜t-C4｜+C3(t-C4)(C1为最大值的估计值，C4为达到最大值的时间，C3-C2表示在达到最大值之前的增加速度，C3+C2表示在达到最大值之后的下降速度)。结果
一、肾小球内细胞总数及增殖细胞数各组比较
肾小球内细胞外基质观察，从病理切片染色及透射电镜照片上来看，肝素及肝素加地塞米松组治疗后细胞外基质明显减少(见表1，N、A、B右下角码为各组治疗天数)。
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表1 低分子肝素治疗系膜增殖性肾小球肾炎大鼠对
肾小球内增生细胞及肾小球内总细胞数的影响(
±s) 组别鼠数
(只)
检测
肾小球数
肾小球内PCNA(+)
细胞平均数
肾小球平均
细胞总数
正常大鼠
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2
20
1.02±0.78a
69.35±0.21a
N2
6
20
4.69±1.23b
43.50±2.32b
A2
6
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20
5.37±1.35b
42.07±3.03b
B2
6
20
4.53±2.01b
45.56±1.98b
N6
6
20
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16.23±1.32c
90.50±3.27c
A6
6
20
10.97±0.98d
83.50±2.08d
B6
6
20
7.01±2.13d
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82.30±1.47d
注：数字上方字母相同者，无显著性差异(P>0.05)，数字不同者，有显著性差异(P<0.05)。
二、24小时尿蛋白排出动力学变化结果
A组、B组与N组比较，其尿蛋白的高峰值均下降，且统计学检验有显著差异，P值均<0.01，见图1。而达到最大值的时间B组较A组早，差异显著(P<0.01)，B组、A组达到最大值的时间均较N组早，差异显著(P<0.01)，3组尿蛋白变化趋势特征比较见表2。讨论
大鼠舌下静脉注射抗Thy1.1MoAb1-22-3，能稳定建立系膜增殖性肾小球肾炎的动物模型[1]。在体外，系膜细胞对抗凝血肝素非常敏感[2]。VanBruggen等研究发现给MRL/LPr小鼠输注肝素可延缓小鼠肾炎的进展[3]。本实验观察了应用低分子肝素后肾小球内细胞数明显减少，而且PCNA阳性的细胞数也明显的减少，提示肝素能抑制肾小球内系膜细胞的增殖。作用机制可能为肝素抑制细胞生长在G1后期及G1-S间期。其抗增殖作用是肝素分子中的5～6个糖基上氧的硫酸化。从病理改变中来看，肾小球中基质明显减少，提示肝素能抑制系膜细胞外基质成份的增加。Floege研究发现肝素能减少纤维细胞生长因子(bFGF)的表达，抑制层连蛋白(Laminin)，Ⅰ型、Ⅳ型胶原蛋白和纤维连接蛋白等合成，从而抑制系膜及基质增生而阻止肾小球的硬化[4]。
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图1 低分子肝素和低分子肝素加地塞米松治疗系膜增生性
肾小球肾炎大鼠对24小时尿蛋白的影响
表2 三组尿蛋白变化趋势特征比较(
±s)N组
A组
B组
Max
164.96±18.27
112.50±12.87
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115.96±13.55
tmax
5.65±0.32
4.84±0.36
4.41±0.36△
tmax之前增加速度
0.49±0.08
0.49±0.08
0.41±0.07
tmax之后下降速度
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-0.27±0.08
-0.28±0.08
0.23±0.07
与N组比，P<0.01，与A组比较，△P<0.01。
本组也观察了肝素和地塞米松的联合治疗作用。肾上腺皮质激素的作用一般认为，主要是对单核巨噬细胞和T淋巴细胞的抑制效应，抑制单核巨噬细胞产生IL-2及Fc段和C3受体的表达，激活的T细胞产生的淋巴因子如IL-2、γ干扰素、IL-6均受抑制。与肝素联合应用，抗炎抗增生作用更强，但从肾小球内细胞总数和增殖细胞数以及尿蛋白排泄动力学改变几个方面来看，其效果并不优于单独肝素治疗组。这与Ando等报道不一致，Ando等研究认为肾上腺糖皮质激素和肝素联合治疗后Caldesmon蛋白表达受抑制，肾炎减轻[5]。至于结果不一致的原因，还有待进一步的研究探讨。
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肝素对尿蛋白排泄动力学的影响，本研究发现肝素能减少尿蛋白的排出，提前尿蛋白的排泄峰值到达，且肝素加地塞米松组尤为明显，也提示地塞米松可加快尿蛋白排泄，但对尿蛋白排泄量的影响不大，其机制还待探讨。Kramers等研究发现，组蛋白可介导与DNA组合的抗DNA抗体与肾小球基底膜上的硫酸类肝素结合。给SLE小鼠体内输入小量肝素，结合抗DNA-CIC，阻断它们与肾小球基底膜结合减轻肾损害[6]，从而减少尿蛋白的排出，但肝素对尿蛋白影响确切机制还有待深入研究。
总之，腹腔注射肝素可抑制大鼠系膜增殖性肾小球肾炎模型中肾小球细胞增殖及肾小球内细胞外基质增加。肾上腺皮质激素与肝素联合使用，并不优于单独使用肝素治疗，机制有待进一步研究。
参考文献
1，夏志银，钱桐荪，蒋季杰，等.单克隆抗体1-22-3诱导大鼠系膜增殖性小肾炎动物模型研究.南通医学院学报，1997，17：468-470.
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2，Guyton JR，Rosenberg RD，Clowes AW，et al.Inhibition of rat raterial smooth muscle cell proliferation by heparin.Circ Res，1980，46：625-634.
3，Van Bruggen MC，Walgreen B，Rijke TP，et al.Heparin and heparinoids prevent the binding of immune complexes containing nucleosomal antigens to the GBM and delay nephritis in MRL/LPr mice.Kidney International，1996，50：1555-1564.
4，Floege J，Eng E，Uoung BA，et al.Heparin suppresses mesangial cell proliferation and matrix expansion in experimental mesangioproliferation glomerulonephritis.Kidney International，1993，43：269-280.
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5，Ando Y，Mori Yama T，Miyazaki，et al.Enhanced glomerular expression of caldesmon in IgA nephropathy and its suppression by glucocorticoid-heparin therapy.Nephrol Dial Transplant，1998，13：1168-1175.
6，Kramers C，HyLKema MN，VanBruggen MC，et al.Anti-nucleosome antibodies complexed to nucle osomal antigens show anti-DNA reactivity and bind to rat glomerular basement membrane in vivo.Journal of clinicl Investigation，1994，94：568-577.
收稿：1999-09-02
修回：2000-04-17, 百拇医药