戊型肝炎血清HEV-RNA的动态变化及其意义
http://www.100md.com
37c医学网
作者：王占英 鲁学恒 庄辉 李颖 乔光彦 田金荣
单位：王占英(中国医科大学第二临床学院传染病科，沈阳 110003)；李颖(中国医科大学第二临床学院传染病科，沈阳 110003)；乔光彦(中国医科大学第二临床学院传染病科，沈阳 110003)；鲁学恒(沈阳铁路分局沈北医院)；庄辉(北京医科大学)；田金荣(阜新市中心医院)
关键词：逆转录巢式聚合酶链反应；戊型肝炎；戊型肝炎病毒；RNA；抗-HEV
中国医科大学学报000224 摘要 目的：探讨戊型肝炎患者血清HEV-RNA的动态变化及其意义。方法：用逆转录-巢式聚合酶链反应检测32例戊型肝炎患者系列血清HEV-RNA。结果：发病后0～7 d，8～14 d，15～21 d，22～28 d患者血清HEV-RNA阳性率分别为96.6%，84.4%，43.8%和9.4%。病后1周内，血清HEV-RNA阳性率明显高于抗-HEV IgM(P<0.05)和抗-HEV IgG阳性率(P<0.01)。病后2周后，抗-HEV IgM和抗-HEV IgG阳性率均明显高于血清HEV-RNA阳性率(P<0.01)。结论：大部分戊型肝炎患者血清HEV-RNA阳性持续至病后2周，少部分持续至病后3周以上。病后1周内，检测血清HEV-RNA作为早期诊断指标最敏感。但病后2周由于血清HEV-RNA部分阴转，抗-HEV阳性率增加，作为诊断指标抗-HEV比HEV-RNA敏感。
, 百拇医药
Dynamics of HEV-RNA in Sera of Patients with Hepatitis E and its Significance
Wang Zhanying, Lu Xueheng, Zhuang Hui, Li Ying, Qiao Guangyan, Tian Jinrong
(Department of Infectious Disease, The Second Clinical College, China Medical University, Shenyang, 110003)
ABSTRACT Objective: This paper was to explore the dynamics of HEV-RNA in the sera of patients with hepatitis E and its significance. Methods: Reverse transcription-nested-polymerase chain reaction (RT-nested PCR) was used to detect HEV-RNA in serial sera of 32 patients with hepatitis E. Results: From the first week to the fourth week after onset of illness the positive rate of HEV-RNA in the sera was 96.6%, 84.4%, 43.8%, and 9.4% respectively. In the first week of the onset, the positive rate of HEV-RNA was higher than those of anti-HEV IgM (P<0.05) and anti-HEV IgG (P<0.01). After two weeks of the onset the positive rates of both anti-HEV IgM and anti-HEV IgG were higher than that of HEV-RNA (P<0.01). Conclusions: HEV-RNA lasted for two weeks after onset of illness for most patients and more than three weeks for a few patients. Within the first week of illness course, detecting HEV-RNA in the sera was most sensitive for early diagnosis. After the second week of the course, detecting anti-HEV was more sensitive for diagnosis than detecting HEV-RNA.
, http://www.100md.com
KEY WORDS RT-nested-PCR;hepatitis E; hepatitis E virus; RNA; anti-HEV IgM; anti-HEV IgG
自1989年Reyes等[1]应用分子克隆技术获得了戊型肝炎病毒(HEV)的基因序列后，各国学者采用逆转录-巢式聚合酶链反应对戊型肝炎(HE)患者的病毒血症进行了研究，但各家报道差异很大。短者病毒血症于发病后10 d内消失，而长者病毒血症持续至发病后52～112 d[2～5]。为进一步探明HE患者病毒血症持续时间和消长规律及其意义，作者采用逆转录-巢式聚合酶链反应，检测32例HE患者系列血清HEV-RNA，并观察其动态变化。
1 材料与方法
1.1 病例来源及标本收集 32例HE患者均系本院传染科住院患者，男25例，女7例，年龄13～74岁，平均年龄45.2±13.2岁。急性黄疸型23例，急性无黄疸型9例。诊断符合1995年第五次全国传染病和寄生虫病学术会议修订的诊断标准[6]。患者于病后0～7 d，8～14 d，15～21 d，22～28 d分别采血。同时收集急性期甲、乙型肝炎患者和正常人血清各10份。血标本立即分离血清，-70℃冻存待检。
, http://www.100md.com
1.2 试剂 Taq DNA多聚酶，dNTP，10×反应缓冲液，异硫氰酸胍，十二烷基肌氨酸钠，AMV逆转录酶和RNasin (Promega公司产品)均购自华美公司北京分公司。抗-HAV，乙肝血清学五项标志试剂由台湾龙华生物科技公司提供。抗-HEV IgM和IgG试剂盒由伊利康公司提供，为北京医科大学肝炎试剂研制中心研制。操作方法及结果判定均严格按说明书进行。本实验采用文献[7]引物序列，由上海细胞生物学研究所合成，其序列为：外正向引物(4459-4478)5′-GCATTATGGAGGAGTGTGG；外反向引物(4877-4858)5′-CCAGGGCCCCAATT-
CTTCTC；内正向引物(4522-4539)5′-GCGTGGATCTTGCAGGCC；内反向引物(4741-4760)5′-TTCAACTTCAAGCCACAGCC。
1.3 血清HEV-RNA提取 参照文献[8]进行。血清100 μl，加裂解液(4 mol/L异硫氰酸胍，0.5%十二烷基肌氨酸钠，25 mmol/L柠檬酸钠，0.1 mmol/L β-巯基乙醇) 500 μl，水饱合酚400 μl，氯仿：异戊醇(49∶1) 200 μl，冰浴20 min后13 000r/min离心15 min，取水相，用等体积的氯仿：异戊醇抽提1次，水相用无水乙醇过夜沉淀，沉淀溶解于40 μl DEPC水中，加入RNasin 20 U，-30℃冻存。
, 百拇医药
1.4 逆转录-巢式聚合酶链反应 参照本室建立的方法[9]进行。第一次PCR反应组成为：10×Buff 5μl，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L各种dNTP共4 μl，外正、反引物各2 μl，AMV逆转录酶3 U，Taq DNA多聚酶2 U，DEPC水溶解的HEV-RNA 36 μl，RNasin 20 U，终体积为50 μl，加石蜡油封顶。42℃ 30 min合成cDNA。然后94℃变性5 min，进行PCR循环。条件为：94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 60 s，共32个循环，最后72℃延伸5 min。第二次PCR反应：取第一次扩增产物5 μl，内正、反引物各2 μl，无AMV逆转录酶，其他反应液组成和反应条件同第一次PCR反应。
1.5 电泳检测 取扩增产物10 μl，在含有0.5
μg/ml EB的聚丙烯酰胺凝胶垂直板上电泳，用紫外检测仪观察结果。第二次PCR扩增产物为239 bp。每次实验均设阳性、阴性和空白对照，且每份样本重复2次，结果一致判为阳性。
, 百拇医药
2 结果
2.1 检测32例HE患者发病后0～28 d血清共125份，血中0～14 d血清61份，55份阳性，阳性率为90.1%。检测急性期甲、乙型肝炎患者和正常人血清各10份无1例阳性。阳性标本在239 bp处出现特异条带，见图1。
图1 血清扩增后电泳结果
1.MW标志 2.阳性对照 4.空白对照
3.5.6.7为戊肝血清 8.急性甲肝血清
9.急性乙肝血清
Figure 1 Electrophoresis of PCR amplified products
, http://www.100md.com
1: MW marker, 2: positive control, 4: blank control
3,5,6,7 sera of HE patients, 8: serum of patient with
acute tepatitis A, 9: serum of patient with acute hepatitis B
2.2 血清HEV-RNA、抗-HEV IgM和抗-HEV IgG动态变化 32例HE患者血清HEV-RNA阳性率从发病后第1周到第4周分别为96.6%，84.4%，43.8%，9.4%。抗-HEV IgM阳性率病后第1周为72.4%，第4周达90.6%。抗-HEV IgG阳性率病后第1周为48.3%，以后逐渐上升，第4周达93.8%。
2.3 血清HEV-RNA与抗-HEV IgM和IgG的比较 32例HE患者发病后1～4周血清HEV-RNA阳性率与抗-HEV IgM和IgG的阳性率比较表明：发病后第1周血清HEV-RNA阳性率明显高于抗-HEV IgM阳性率(P1<0.05)和抗-HEV IgG阳性率(P2<0.01)；病后第2周血清HEV-RNA阳性率与抗-HEV IgM和IgG阳性率无明显差异；病后3、4周抗-HEV IgM和IgG阳性率均显著高于血清HEV-RNA阳性率(P1<0.01，P2<0.01)，见表1。
, 百拇医药
表1 血清HEV-RNA与抗-HEV IgM和IgG阳性率比较
Table 1 Comparison of positive rate of serum HEV RNA with anti-HEV IgM and IgG 发病后
天数
血清
份数
HEV-RNA
抗-HEV IgM
抗-HEV IgG
P1
P2
, 百拇医药
阳性数
阳性率(%)
阳性数
阳性率(%)
阳性数
阳性率(%)
0～7
29
28
96.6
21
72.4
14
, 百拇医药
48.3
<0.05
<0.01
8～14
32
27
84.4
25
78.1
23
71.9
>0.05
>0.05
, 百拇医药
15～21
32
14
43.8
27
84.4
27
84.4
<0.01
<0.01
22～28
32
3
, 百拇医药
9.4
29
90.6
30
93.8
<0.01
<0.01
注：P1为HEV-RNA与抗-HEV IgM比较，P2为HEV-RNA与抗-HEV IgG比较
3 讨论
逆转录-巢式聚合酶链反应检测血清HEV-RNA有较强的特异性和较高的敏感性。本实验所得扩增片断的大小完全符合2对引物限制的区段，且与阳性对照一致，而急性甲、乙型肝炎病人和正常人血清扩增结果均阴性。表明该PCR方法有较强的特异性。该PCR方法检测病后2周内血清HEV-RNA阳性率为90.1%，这与国外报道HE患者病后2周内血清HEV-RNA阳性率73%～91%相一致[4，5]。表明该法有较高的敏感性。
, http://www.100md.com
本组戊型肝炎患者血清HEV-RNA阳性率第1周为96.6%，第2周为84.4%，第3周为43.8%，第4周仅为9.4%，说明大部分HE患者病毒血症持续至病后2周，仅少部分患者病毒血症持续至病后3周以上。这与实验感染动物模型病毒血症的持续时间大致相同[10]。也与HE患者血清HEV-RNA的研究结果基本一致[3]。另有文献报道，戊型肝炎病毒感染后病毒血症持续时间较短[2]，可能与其观察例数少，观察时间短有关。本结果表明，病后3周43.8%的HE患者有病毒血症，病后第4周仍有9.4%的患者血清HEV-RNA阳性，1例病毒血症持续至病后28 d仍然阳性，表明少部分HE患者病毒血症持续时间较长，这样可能使HEV有了经肠道外传播的机会，故对献血员检测HEV-RNA可能是必要的。
戊型肝炎患者病后1周内，血清HEV-RNA阳性率明显高于抗-HEV IgM和IgG的阳性率，表明病后1周内血清HEV-RNA作为早期诊断指标最敏感。发病2周后血清HEV-RNA大部分阴转，检出率降低，而抗-HEV IgM和IgG阳性率明显增加，故发病2周后抗-HEV作为诊断指标比血清HEV-RNA敏感。
, 百拇医药
卫生部科研基金资助项目，91312293
参考文献
1，Reyes GR, Purdy MA, Kim JP, et al. Isolation of a cDNA from the virus responsible for enterically transmitted non-A, non-B hepatitis. Science, 1990,247:1335_1339
2，Schlander GG, Dawson GJ, Mushahwar IK, et al. Viraemia in Egyptian children with hepatitis E virus infection. Lancet, 1993,341:378
3，Chauhan A, Jameel S, Dilawari J, et al. Hepatitis E virus transmission to a volunteer. Lancet, 1993,341:149_150
, 百拇医药
4，Clayson ET, Myint KSA, Snitbhan R, et al. Viremia, fecal shedding, and IgM and IgG responses in patients with hepatitis E. J Infect Dis, 1995,172:927_933
5，Nanda SK, Ansari IH, Acharya SK, et al. Protracted viremia during acute sporadic hepatitis E virus infection. Gastroenterology, 1995,108:225_230
6，病毒性肝炎防治方案(试行).中华传染病杂志，1995，13：241～247
7，Ray R, Aggarwal R, Salunke PN, et al. Hepatitis E virus genome in stools of hepatitis patients during large epidemic in north India. Lancet, 1991,338:783_784
, 百拇医药
8，Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method RNA isolation by acid-guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987,162:156_159
9，鲁学恒，李颖，王占英，等.逆转录-巢式聚合酶链反应检测戊型肝炎病毒核酸方法的建立.中国医科大学学报，1998，27(3)：270～271
10，Tsarev SA, Emerson SU, Tsareva TS, et al. Variation in course of hepatitis E in experimentally infected cynomolgus monkeys. J Infect Dis, 1992,167:1302_1306
(1999-03-23收稿), http://www.100md.com
单位：王占英(中国医科大学第二临床学院传染病科，沈阳 110003)；李颖(中国医科大学第二临床学院传染病科，沈阳 110003)；乔光彦(中国医科大学第二临床学院传染病科，沈阳 110003)；鲁学恒(沈阳铁路分局沈北医院)；庄辉(北京医科大学)；田金荣(阜新市中心医院)
关键词：逆转录巢式聚合酶链反应；戊型肝炎；戊型肝炎病毒；RNA；抗-HEV
中国医科大学学报000224 摘要 目的：探讨戊型肝炎患者血清HEV-RNA的动态变化及其意义。方法：用逆转录-巢式聚合酶链反应检测32例戊型肝炎患者系列血清HEV-RNA。结果：发病后0～7 d，8～14 d，15～21 d，22～28 d患者血清HEV-RNA阳性率分别为96.6%，84.4%，43.8%和9.4%。病后1周内，血清HEV-RNA阳性率明显高于抗-HEV IgM(P<0.05)和抗-HEV IgG阳性率(P<0.01)。病后2周后，抗-HEV IgM和抗-HEV IgG阳性率均明显高于血清HEV-RNA阳性率(P<0.01)。结论：大部分戊型肝炎患者血清HEV-RNA阳性持续至病后2周，少部分持续至病后3周以上。病后1周内，检测血清HEV-RNA作为早期诊断指标最敏感。但病后2周由于血清HEV-RNA部分阴转，抗-HEV阳性率增加，作为诊断指标抗-HEV比HEV-RNA敏感。
, 百拇医药
Dynamics of HEV-RNA in Sera of Patients with Hepatitis E and its Significance
Wang Zhanying, Lu Xueheng, Zhuang Hui, Li Ying, Qiao Guangyan, Tian Jinrong
(Department of Infectious Disease, The Second Clinical College, China Medical University, Shenyang, 110003)
ABSTRACT Objective: This paper was to explore the dynamics of HEV-RNA in the sera of patients with hepatitis E and its significance. Methods: Reverse transcription-nested-polymerase chain reaction (RT-nested PCR) was used to detect HEV-RNA in serial sera of 32 patients with hepatitis E. Results: From the first week to the fourth week after onset of illness the positive rate of HEV-RNA in the sera was 96.6%, 84.4%, 43.8%, and 9.4% respectively. In the first week of the onset, the positive rate of HEV-RNA was higher than those of anti-HEV IgM (P<0.05) and anti-HEV IgG (P<0.01). After two weeks of the onset the positive rates of both anti-HEV IgM and anti-HEV IgG were higher than that of HEV-RNA (P<0.01). Conclusions: HEV-RNA lasted for two weeks after onset of illness for most patients and more than three weeks for a few patients. Within the first week of illness course, detecting HEV-RNA in the sera was most sensitive for early diagnosis. After the second week of the course, detecting anti-HEV was more sensitive for diagnosis than detecting HEV-RNA.
, http://www.100md.com
KEY WORDS RT-nested-PCR;hepatitis E; hepatitis E virus; RNA; anti-HEV IgM; anti-HEV IgG
自1989年Reyes等[1]应用分子克隆技术获得了戊型肝炎病毒(HEV)的基因序列后，各国学者采用逆转录-巢式聚合酶链反应对戊型肝炎(HE)患者的病毒血症进行了研究，但各家报道差异很大。短者病毒血症于发病后10 d内消失，而长者病毒血症持续至发病后52～112 d[2～5]。为进一步探明HE患者病毒血症持续时间和消长规律及其意义，作者采用逆转录-巢式聚合酶链反应，检测32例HE患者系列血清HEV-RNA，并观察其动态变化。
1 材料与方法
1.1 病例来源及标本收集 32例HE患者均系本院传染科住院患者，男25例，女7例，年龄13～74岁，平均年龄45.2±13.2岁。急性黄疸型23例，急性无黄疸型9例。诊断符合1995年第五次全国传染病和寄生虫病学术会议修订的诊断标准[6]。患者于病后0～7 d，8～14 d，15～21 d，22～28 d分别采血。同时收集急性期甲、乙型肝炎患者和正常人血清各10份。血标本立即分离血清，-70℃冻存待检。
, http://www.100md.com
1.2 试剂 Taq DNA多聚酶，dNTP，10×反应缓冲液，异硫氰酸胍，十二烷基肌氨酸钠，AMV逆转录酶和RNasin (Promega公司产品)均购自华美公司北京分公司。抗-HAV，乙肝血清学五项标志试剂由台湾龙华生物科技公司提供。抗-HEV IgM和IgG试剂盒由伊利康公司提供，为北京医科大学肝炎试剂研制中心研制。操作方法及结果判定均严格按说明书进行。本实验采用文献[7]引物序列，由上海细胞生物学研究所合成，其序列为：外正向引物(4459-4478)5′-GCATTATGGAGGAGTGTGG；外反向引物(4877-4858)5′-CCAGGGCCCCAATT-
CTTCTC；内正向引物(4522-4539)5′-GCGTGGATCTTGCAGGCC；内反向引物(4741-4760)5′-TTCAACTTCAAGCCACAGCC。
1.3 血清HEV-RNA提取 参照文献[8]进行。血清100 μl，加裂解液(4 mol/L异硫氰酸胍，0.5%十二烷基肌氨酸钠，25 mmol/L柠檬酸钠，0.1 mmol/L β-巯基乙醇) 500 μl，水饱合酚400 μl，氯仿：异戊醇(49∶1) 200 μl，冰浴20 min后13 000r/min离心15 min，取水相，用等体积的氯仿：异戊醇抽提1次，水相用无水乙醇过夜沉淀，沉淀溶解于40 μl DEPC水中，加入RNasin 20 U，-30℃冻存。
, 百拇医药
1.4 逆转录-巢式聚合酶链反应 参照本室建立的方法[9]进行。第一次PCR反应组成为：10×Buff 5μl，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L各种dNTP共4 μl，外正、反引物各2 μl，AMV逆转录酶3 U，Taq DNA多聚酶2 U，DEPC水溶解的HEV-RNA 36 μl，RNasin 20 U，终体积为50 μl，加石蜡油封顶。42℃ 30 min合成cDNA。然后94℃变性5 min，进行PCR循环。条件为：94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 60 s，共32个循环，最后72℃延伸5 min。第二次PCR反应：取第一次扩增产物5 μl，内正、反引物各2 μl，无AMV逆转录酶，其他反应液组成和反应条件同第一次PCR反应。
1.5 电泳检测 取扩增产物10 μl，在含有0.5
μg/ml EB的聚丙烯酰胺凝胶垂直板上电泳，用紫外检测仪观察结果。第二次PCR扩增产物为239 bp。每次实验均设阳性、阴性和空白对照，且每份样本重复2次，结果一致判为阳性。
, 百拇医药
2 结果
2.1 检测32例HE患者发病后0～28 d血清共125份，血中0～14 d血清61份，55份阳性，阳性率为90.1%。检测急性期甲、乙型肝炎患者和正常人血清各10份无1例阳性。阳性标本在239 bp处出现特异条带，见图1。
图1 血清扩增后电泳结果
1.MW标志 2.阳性对照 4.空白对照
3.5.6.7为戊肝血清 8.急性甲肝血清
9.急性乙肝血清
Figure 1 Electrophoresis of PCR amplified products
, http://www.100md.com
1: MW marker, 2: positive control, 4: blank control
3,5,6,7 sera of HE patients, 8: serum of patient with
acute tepatitis A, 9: serum of patient with acute hepatitis B
2.2 血清HEV-RNA、抗-HEV IgM和抗-HEV IgG动态变化 32例HE患者血清HEV-RNA阳性率从发病后第1周到第4周分别为96.6%，84.4%，43.8%，9.4%。抗-HEV IgM阳性率病后第1周为72.4%，第4周达90.6%。抗-HEV IgG阳性率病后第1周为48.3%，以后逐渐上升，第4周达93.8%。
2.3 血清HEV-RNA与抗-HEV IgM和IgG的比较 32例HE患者发病后1～4周血清HEV-RNA阳性率与抗-HEV IgM和IgG的阳性率比较表明：发病后第1周血清HEV-RNA阳性率明显高于抗-HEV IgM阳性率(P1<0.05)和抗-HEV IgG阳性率(P2<0.01)；病后第2周血清HEV-RNA阳性率与抗-HEV IgM和IgG阳性率无明显差异；病后3、4周抗-HEV IgM和IgG阳性率均显著高于血清HEV-RNA阳性率(P1<0.01，P2<0.01)，见表1。
, 百拇医药
表1 血清HEV-RNA与抗-HEV IgM和IgG阳性率比较
Table 1 Comparison of positive rate of serum HEV RNA with anti-HEV IgM and IgG 发病后
天数
血清
份数
HEV-RNA
抗-HEV IgM
抗-HEV IgG
P1
P2
, 百拇医药
阳性数
阳性率(%)
阳性数
阳性率(%)
阳性数
阳性率(%)
0～7
29
28
96.6
21
72.4
14
, 百拇医药
48.3
<0.05
<0.01
8～14
32
27
84.4
25
78.1
23
71.9
>0.05
>0.05
, 百拇医药
15～21
32
14
43.8
27
84.4
27
84.4
<0.01
<0.01
22～28
32
3
, 百拇医药
9.4
29
90.6
30
93.8
<0.01
<0.01
注：P1为HEV-RNA与抗-HEV IgM比较，P2为HEV-RNA与抗-HEV IgG比较
3 讨论
逆转录-巢式聚合酶链反应检测血清HEV-RNA有较强的特异性和较高的敏感性。本实验所得扩增片断的大小完全符合2对引物限制的区段，且与阳性对照一致，而急性甲、乙型肝炎病人和正常人血清扩增结果均阴性。表明该PCR方法有较强的特异性。该PCR方法检测病后2周内血清HEV-RNA阳性率为90.1%，这与国外报道HE患者病后2周内血清HEV-RNA阳性率73%～91%相一致[4，5]。表明该法有较高的敏感性。
, http://www.100md.com
本组戊型肝炎患者血清HEV-RNA阳性率第1周为96.6%，第2周为84.4%，第3周为43.8%，第4周仅为9.4%，说明大部分HE患者病毒血症持续至病后2周，仅少部分患者病毒血症持续至病后3周以上。这与实验感染动物模型病毒血症的持续时间大致相同[10]。也与HE患者血清HEV-RNA的研究结果基本一致[3]。另有文献报道，戊型肝炎病毒感染后病毒血症持续时间较短[2]，可能与其观察例数少，观察时间短有关。本结果表明，病后3周43.8%的HE患者有病毒血症，病后第4周仍有9.4%的患者血清HEV-RNA阳性，1例病毒血症持续至病后28 d仍然阳性，表明少部分HE患者病毒血症持续时间较长，这样可能使HEV有了经肠道外传播的机会，故对献血员检测HEV-RNA可能是必要的。
戊型肝炎患者病后1周内，血清HEV-RNA阳性率明显高于抗-HEV IgM和IgG的阳性率，表明病后1周内血清HEV-RNA作为早期诊断指标最敏感。发病2周后血清HEV-RNA大部分阴转，检出率降低，而抗-HEV IgM和IgG阳性率明显增加，故发病2周后抗-HEV作为诊断指标比血清HEV-RNA敏感。
, 百拇医药
卫生部科研基金资助项目，91312293
参考文献
1，Reyes GR, Purdy MA, Kim JP, et al. Isolation of a cDNA from the virus responsible for enterically transmitted non-A, non-B hepatitis. Science, 1990,247:1335_1339
2，Schlander GG, Dawson GJ, Mushahwar IK, et al. Viraemia in Egyptian children with hepatitis E virus infection. Lancet, 1993,341:378
3，Chauhan A, Jameel S, Dilawari J, et al. Hepatitis E virus transmission to a volunteer. Lancet, 1993,341:149_150
, 百拇医药
4，Clayson ET, Myint KSA, Snitbhan R, et al. Viremia, fecal shedding, and IgM and IgG responses in patients with hepatitis E. J Infect Dis, 1995,172:927_933
5，Nanda SK, Ansari IH, Acharya SK, et al. Protracted viremia during acute sporadic hepatitis E virus infection. Gastroenterology, 1995,108:225_230
6，病毒性肝炎防治方案(试行).中华传染病杂志，1995，13：241～247
7，Ray R, Aggarwal R, Salunke PN, et al. Hepatitis E virus genome in stools of hepatitis patients during large epidemic in north India. Lancet, 1991,338:783_784
, 百拇医药
8，Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method RNA isolation by acid-guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987,162:156_159
9，鲁学恒，李颖，王占英，等.逆转录-巢式聚合酶链反应检测戊型肝炎病毒核酸方法的建立.中国医科大学学报，1998，27(3)：270～271
10，Tsarev SA, Emerson SU, Tsareva TS, et al. Variation in course of hepatitis E in experimentally infected cynomolgus monkeys. J Infect Dis, 1992,167:1302_1306
(1999-03-23收稿), http://www.100md.com