东亚钳蝎毒素多肽纯化组份BmK AS-1对大鼠背根神经节神经元河豚毒素不敏感型钠通道电流的作用
http://www.100md.com
南京医科大学学报 2000年第4期第20卷 论著
作者：毛霞 肖杭 谭智勇 石云 赵志奇 吉永华
单位：毛霞 肖杭(南京医科大学应用毒理研究所， 南京 210029)；谭智勇 石云 赵志奇 吉永华(中国科学院上海生理研究所， 上海 200031)
关键词：东亚钳蝎；蝎毒液类；神经节；脊；膜片箝
南京医科大学学报000402
摘 要 目的 研究国产东亚钳蝎(Buthus martensi Karsch, BmK)毒素多肽的纯化单体组份BmK AS-1对大鼠背根神经节(DRG)神经元河豚毒素不敏感(TTX-R)钠电流的作用。方法 采用膜片箝全细胞记录方法，观察BmK AS-1对单个DRG细胞TTX-R钠电流幅值的影响。结果 BmK AS-1剂量依赖地抑制TTX-R钠电流，且高剂量(10 μg/ml)BmK AS-1几乎完全抑制TTX-R钠电流，其抑制作用不可逆。结论 BmK AS-1显著抑制TTX-R钠电流，这种抑制作用可能是其镇痛作用的机理之一。
, http://www.100md.com
中图号 R384.9
Effects of BmK AS-1 on TTX-R Sodium Channel Currents in Rat DRG Neurons
Mao Xia, Xiao Hang, Tan Zhiyong, et al.
(Institute of Applied Toxicology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029)
Abstract Objective To investigate the effect of BmK AS-1 on TTX-R sodium currents in rat DRG neurons. Methods The whole-cell patch-clamp recording technique was used in this study. Results BmK AS-1 suppressed the amplitude of the TTX-R sodium currents in a dose-dependent way. The inhibition effect was irreversible at high dosage. Conclusion BmK AS-1 significantly inhibits the TTX-R sodium currents and that may acconnt for its analgesic effect.
, 百拇医药
Key words Buthus martensi Karsch; scorpion venoms; genglia, spinal; patch-clamp
东亚钳蝎(Buthus martensi Karsch,BmK)是广泛分布于我国长江以北延伸至蒙古和朝鲜半岛的节肢动物，BmK AS-1是新近从BmK粗毒液中提纯的由66个氨基酸组成的活性多肽。我们以往的工作发现BmK AS-1局部感受野和鞘内注射对皮肤痛有一定抑制作用[1]，但其镇痛作用机理却不甚明了。近年来钠通道和痛觉的关系越来越受到人们的关注，鉴于BmK AS-1与一种非洲产蝎抗昆虫毒素多肽AaHIT4间具有高达83%的序列同源性[2]，而AaHIT4已被描述是一个独特的钠通道配体。本研究着重观察了BmK AS-1对大鼠背根神经节(DRG)细胞河豚毒素不敏感(TTX-R)钠电流的作用，探讨其镇痛作用的可能机理。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 材料
所用胶原酶、胰蛋白酶和DNase酶均为Sigma公司产品，河豚毒素(TTX)购于河北省水产研究所，BmK AS-1由中国科学院上海生理研究所纯化[3]。健康成年SD大鼠由江苏省实验动物中心提供，雌雄兼用。
1.2 DRG神经元的分离
大鼠击昏后断头，迅速分离胸至腰段脊柱并将脊柱纵向剖为两半，挑去脊髓，用游丝镊 从椎间孔处取出DRG放入0℃的由Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)所配培养液中。剪掉DRG两侧的神经干移出培养液，置装有胶原酶的烧杯(1 g/L培养液)，于(32±1)℃消化1 h后，用新鲜培养液清洗数次，移至装有胰酶的烧杯(0.5 g/L培养液)，消化35～45 min，温度同前，用细胞外液清洗数次，移至含DNase酶的外液中(0.1 g/L外液)，用两个系列的吸管轻轻吹打数次后，分装于几只直径35 mm的塑料培养皿中，静置30 min后开始实验。用自制的加药装置加药，将所需浓度的药物配好，经内径100 μm的管子流出，包绕细胞形成轴流，药液便以终浓度的形式直接加到细胞上。
, http://www.100md.com
1.3 实验所用溶液
细胞外液成分(mmol/L):NaCl 140, KCl 5,CaCl2 2.5, MgCl2 1, HEPES 10, D-glucose 10。用1mol/L NaOH调pH至7.3～7.4后20℃保存。
电极内液成分(mmol/L): NaF 140, CsCl 120, TEACl 20, Na2ATP 5, 乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA) 10, HEPES 10, MgCl2 5, Na2GTP 0.4。用CsOH调pH至7.3，20℃保存。
TTX和BmK AS-1均溶于生理盐水20℃保存，临用前用细胞外液稀释成所需浓度。
1.4 全细胞电压箝记录
, 百拇医药
记录玻璃微电极由毛细管(内径1.6 mm，中国科学院上海脑研究所)经二步拉制仪(Narishige PP-83)垂直拉制而成，充灌电极内液后使用。整个过程在计算机监控下进行，用负压吸住细胞，缓慢加大负压使电极尖端与细胞膜封接，直至封接电阻达GΩ以上，然后用负压吸破细胞或用zap功能输出电流击穿胞膜，得到全细胞构型。而后置维持电压于70 mV，膜电流由一组从60 mV到+30 mV、以10 mV递增的、波宽为50 ms的指令电压方波诱发，得到内向钠电流后，经加药管加入1 μmol/L的TTX后所得电流即为TTX不敏感(TTX-R)钠电流。实验过程中以0.2～0.5 μmol/L的TTX维持。
实验所用的细胞直径均在10～25 μm之间。参考电极为Ag-AgCl电极，采集和滤波频率分别为20kHz和3 kHz，所记录的电流经放大器(EPC-9，HEKA，German)放大后，由Pulse软件采集储存于计算机中，用Igor和SigmaPlot软件分析处理数据。所有的实验均在室温20℃～22℃进行。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 TTX-R钠电流的分离
通常细胞破膜后，首先记录到的是一先内向后外向的全电流(图1)，内向流主要由钠和钙电流组成，外向流主要是钾电流。随着电极内液的渗入，外向钾电流被Cs+和四乙铵所阻断，钙电流则被胞内的EGTA、F-和相对高浓度(5 mmol/L)的Mg2+阻断，所剩内向电流主要为钠电流(图2)。经加药管加入1 μmol/L的TTX后，得到TTX-R钠电流(图3)。由图2和图3可看出，TTX-R钠电流到达峰电流的时间和通道失活明显要慢得多。
2.2 BmK AS-1对TTX-R钠电流的作用
BmK AS-1 10 μg/ml可明显抑制TTX-R钠电流，其抑制率达(84.15±17.63)%(n=6)，用细胞外液冲洗未见明显恢复(图4)。1 μg/ml和0.2 μg/ml的BmK AS-1对TTX-R钠电流的抑制率分别为(35.37±5.43)%(n=8)、(16.13±1.64)%(n=4)，其间呈现出明显的剂量反应关系(图5)，解离常数(KR)和Hill系数(h)分别为1.65 μg/ml和1.03。
, 百拇医药
图1 大鼠DRG细胞电流图
图2 大鼠DRG细胞钠电流图
图3 大鼠DRG细胞TTX-R钠电流图
图4 BmK AS-1对大鼠DRG细胞TTX-R钠电流的作用
图5 BmK AS-1对DRG细胞TTX-R钠电流的剂量反
应关系曲线
, 百拇医药
3 讨 论
DRG位于脊神经的后根，其内含许多初级感觉神经元的胞体和神经纤维，有髓纤维中最细的一类(Aδ类)和无髓纤维(C类)负责传送伤害感受信号。外周伤害性传入引起此类纤维末梢释放P物质和谷氨酸，与脊髓背角内神经激肽1型(NK-1)、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)和非NMDA受体结合，一方面激活背角痛敏神经元向中枢传递痛信息，另一方面也激活背角内阿片肽和γ-氨基丁酸(GABA)能神经元，通过突触前和突触后抑制调制痛觉信息的传入[4]。
当外周神经末梢受到有害的化学、机械或热刺激时会产生疼痛感觉。电压门控的钠通道是一种跨膜糖蛋白，众多可兴奋细胞动作电位的上升相是由钠通道开放钠离子内流而引起的[5]。越来越多的证据表明，由神经元离断或坐骨神经慢性结扎所造成的神经病理性痛觉模型，或炎症痛模型可引起初级感觉神经元上钠通道表达和分布的改变[6，7]。最近的研究表明，用痛敏原处理小直径DRG神经元可导致其上TTX-R钠电流的增加[8～10]，同时有实验证实，主要表达在小直径DRG神经元上产生TTX-R钠电流的两种同源钠通道rPN3和SNS，在慢性压榨引起的轴突损伤部位产生富集[11]。这些均提示由损伤导致的外周神经元的高敏感性与钠通道有关。临床资料也证明利多卡因等钠通道阻断剂在治疗慢性疼痛中疗效显著[12]。
, 百拇医药
本研究结果表明，BmK AS-1可明显抑制TTX-R钠电流的幅度，与其镇痛作用一致，其抑制作用也表现出浓度依赖性。我们可以推测，BmK AS-1通过抑制与痛觉传入密切相关的TTX-R钠通道的活性，影响痛觉传导神经元外周末梢的敏感性，从而发挥其外周镇痛作用。或者说，BmK AS-1对TTX-R钠通道电流的抑制作用是其镇痛作用的可能机理之一。
国家自然科学基金(39870702)，国家新药研究基金(96-901-05-208)，江苏省自然科学基金(BK95076301)资助项目
参考文献
1，肖 杭，毛 霞，谭智勇，等.东亚钳蝎毒素多肽BmK AS-1对大鼠皮肤痛觉的影响.中国药理学与毒理学杂志，修回中
2，Liu Y, Ren HM, Ji YH, et al. Purification and the partial amino acid sequence of a novel activator of ryanodine receptor (BmK AS-1) from mammalian skeletal muscle. Biomedical Res, 1996,17:451
, http://www.100md.com
3，Ji YH, Li YJ, Zhang JW, et al. Covalent structures of BmK AS and BmK AS-1, two novel bioactive polypeptides purified from Chinese scorpion Buthus martensi karsch. Toxicon, 1999,37:519
4，Treede RD. Transmission properties of primary nociceptive afferents. Ross Fiziol ZH Im I M Sechenova, 1999,85(1):205
5，刘安西，陈守同编译.细胞膜离子通道.北京：中央民族学院出版社，1990.1～3
6，Michsel JC, Matk AS, Makoto T, et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature, 1997,389(23):816
, 百拇医药
7，Dib-Hajj S, Black JA, Felts P, et al. Downregulation of transcripts for Na channel alpha-SNS in spinal sensory neurons following axotomy. Proc Natl Acad Sci, 1999,93:14950
8，Michael SG, David BR, Michawl JS, et al. Hyperalgesic agents increase a tetrodotoxin-resistant Na+ current in nociceptors. Proc Natl Acad Sci, 1996,93:1108
9，Gould HJ, Gould YN, Paul D, et al. Development of inflammatory hypersensitivity and augmentation of sodium channels in rat dorsal root ganglia. Brain Research, 1999,824:296
, 百拇医药
10，Armen NA, Lucia S, John NW. A tetrodotoxin-resistant voltage-gated sodium channel expressed by sensory neurons. Nature, 1996,379(18):257
11，Novakovic SD, Tzoumaka E, Mcgivern JG, et al. Distribution of the tetrodotoxin-resistant sodium channel PN3 in rat sensory neurons in normal and neuropathic conditions. J Neurosci, 1998,18(6):2174
12，Tanelian DL, Victory RA. Sodium channel blocking agents: their use in neuropathic pain conditions. Pain Forum, 1995,4:75
(1999-12-14收稿)
, 百拇医药
单位：毛霞 肖杭(南京医科大学应用毒理研究所， 南京 210029)；谭智勇 石云 赵志奇 吉永华(中国科学院上海生理研究所， 上海 200031)
关键词：东亚钳蝎；蝎毒液类；神经节；脊；膜片箝
南京医科大学学报000402
摘 要 目的 研究国产东亚钳蝎(Buthus martensi Karsch, BmK)毒素多肽的纯化单体组份BmK AS-1对大鼠背根神经节(DRG)神经元河豚毒素不敏感(TTX-R)钠电流的作用。方法 采用膜片箝全细胞记录方法，观察BmK AS-1对单个DRG细胞TTX-R钠电流幅值的影响。结果 BmK AS-1剂量依赖地抑制TTX-R钠电流，且高剂量(10 μg/ml)BmK AS-1几乎完全抑制TTX-R钠电流，其抑制作用不可逆。结论 BmK AS-1显著抑制TTX-R钠电流，这种抑制作用可能是其镇痛作用的机理之一。
, http://www.100md.com
中图号 R384.9
Effects of BmK AS-1 on TTX-R Sodium Channel Currents in Rat DRG Neurons
Mao Xia, Xiao Hang, Tan Zhiyong, et al.
(Institute of Applied Toxicology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029)
Abstract Objective To investigate the effect of BmK AS-1 on TTX-R sodium currents in rat DRG neurons. Methods The whole-cell patch-clamp recording technique was used in this study. Results BmK AS-1 suppressed the amplitude of the TTX-R sodium currents in a dose-dependent way. The inhibition effect was irreversible at high dosage. Conclusion BmK AS-1 significantly inhibits the TTX-R sodium currents and that may acconnt for its analgesic effect.
, 百拇医药
Key words Buthus martensi Karsch; scorpion venoms; genglia, spinal; patch-clamp
东亚钳蝎(Buthus martensi Karsch,BmK)是广泛分布于我国长江以北延伸至蒙古和朝鲜半岛的节肢动物，BmK AS-1是新近从BmK粗毒液中提纯的由66个氨基酸组成的活性多肽。我们以往的工作发现BmK AS-1局部感受野和鞘内注射对皮肤痛有一定抑制作用[1]，但其镇痛作用机理却不甚明了。近年来钠通道和痛觉的关系越来越受到人们的关注，鉴于BmK AS-1与一种非洲产蝎抗昆虫毒素多肽AaHIT4间具有高达83%的序列同源性[2]，而AaHIT4已被描述是一个独特的钠通道配体。本研究着重观察了BmK AS-1对大鼠背根神经节(DRG)细胞河豚毒素不敏感(TTX-R)钠电流的作用，探讨其镇痛作用的可能机理。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 材料
所用胶原酶、胰蛋白酶和DNase酶均为Sigma公司产品，河豚毒素(TTX)购于河北省水产研究所，BmK AS-1由中国科学院上海生理研究所纯化[3]。健康成年SD大鼠由江苏省实验动物中心提供，雌雄兼用。
1.2 DRG神经元的分离
大鼠击昏后断头，迅速分离胸至腰段脊柱并将脊柱纵向剖为两半，挑去脊髓，用游丝镊 从椎间孔处取出DRG放入0℃的由Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)所配培养液中。剪掉DRG两侧的神经干移出培养液，置装有胶原酶的烧杯(1 g/L培养液)，于(32±1)℃消化1 h后，用新鲜培养液清洗数次，移至装有胰酶的烧杯(0.5 g/L培养液)，消化35～45 min，温度同前，用细胞外液清洗数次，移至含DNase酶的外液中(0.1 g/L外液)，用两个系列的吸管轻轻吹打数次后，分装于几只直径35 mm的塑料培养皿中，静置30 min后开始实验。用自制的加药装置加药，将所需浓度的药物配好，经内径100 μm的管子流出，包绕细胞形成轴流，药液便以终浓度的形式直接加到细胞上。
, http://www.100md.com
1.3 实验所用溶液
细胞外液成分(mmol/L):NaCl 140, KCl 5,CaCl2 2.5, MgCl2 1, HEPES 10, D-glucose 10。用1mol/L NaOH调pH至7.3～7.4后20℃保存。
电极内液成分(mmol/L): NaF 140, CsCl 120, TEACl 20, Na2ATP 5, 乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA) 10, HEPES 10, MgCl2 5, Na2GTP 0.4。用CsOH调pH至7.3，20℃保存。
TTX和BmK AS-1均溶于生理盐水20℃保存，临用前用细胞外液稀释成所需浓度。
1.4 全细胞电压箝记录
, 百拇医药
记录玻璃微电极由毛细管(内径1.6 mm，中国科学院上海脑研究所)经二步拉制仪(Narishige PP-83)垂直拉制而成，充灌电极内液后使用。整个过程在计算机监控下进行，用负压吸住细胞，缓慢加大负压使电极尖端与细胞膜封接，直至封接电阻达GΩ以上，然后用负压吸破细胞或用zap功能输出电流击穿胞膜，得到全细胞构型。而后置维持电压于70 mV，膜电流由一组从60 mV到+30 mV、以10 mV递增的、波宽为50 ms的指令电压方波诱发，得到内向钠电流后，经加药管加入1 μmol/L的TTX后所得电流即为TTX不敏感(TTX-R)钠电流。实验过程中以0.2～0.5 μmol/L的TTX维持。
实验所用的细胞直径均在10～25 μm之间。参考电极为Ag-AgCl电极，采集和滤波频率分别为20kHz和3 kHz，所记录的电流经放大器(EPC-9，HEKA，German)放大后，由Pulse软件采集储存于计算机中，用Igor和SigmaPlot软件分析处理数据。所有的实验均在室温20℃～22℃进行。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 TTX-R钠电流的分离
通常细胞破膜后，首先记录到的是一先内向后外向的全电流(图1)，内向流主要由钠和钙电流组成，外向流主要是钾电流。随着电极内液的渗入，外向钾电流被Cs+和四乙铵所阻断，钙电流则被胞内的EGTA、F-和相对高浓度(5 mmol/L)的Mg2+阻断，所剩内向电流主要为钠电流(图2)。经加药管加入1 μmol/L的TTX后，得到TTX-R钠电流(图3)。由图2和图3可看出，TTX-R钠电流到达峰电流的时间和通道失活明显要慢得多。
2.2 BmK AS-1对TTX-R钠电流的作用
BmK AS-1 10 μg/ml可明显抑制TTX-R钠电流，其抑制率达(84.15±17.63)%(n=6)，用细胞外液冲洗未见明显恢复(图4)。1 μg/ml和0.2 μg/ml的BmK AS-1对TTX-R钠电流的抑制率分别为(35.37±5.43)%(n=8)、(16.13±1.64)%(n=4)，其间呈现出明显的剂量反应关系(图5)，解离常数(KR)和Hill系数(h)分别为1.65 μg/ml和1.03。
, 百拇医药
图1 大鼠DRG细胞电流图
图2 大鼠DRG细胞钠电流图
图3 大鼠DRG细胞TTX-R钠电流图
图4 BmK AS-1对大鼠DRG细胞TTX-R钠电流的作用
图5 BmK AS-1对DRG细胞TTX-R钠电流的剂量反
应关系曲线
, 百拇医药
3 讨 论
DRG位于脊神经的后根，其内含许多初级感觉神经元的胞体和神经纤维，有髓纤维中最细的一类(Aδ类)和无髓纤维(C类)负责传送伤害感受信号。外周伤害性传入引起此类纤维末梢释放P物质和谷氨酸，与脊髓背角内神经激肽1型(NK-1)、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)和非NMDA受体结合，一方面激活背角痛敏神经元向中枢传递痛信息，另一方面也激活背角内阿片肽和γ-氨基丁酸(GABA)能神经元，通过突触前和突触后抑制调制痛觉信息的传入[4]。
当外周神经末梢受到有害的化学、机械或热刺激时会产生疼痛感觉。电压门控的钠通道是一种跨膜糖蛋白，众多可兴奋细胞动作电位的上升相是由钠通道开放钠离子内流而引起的[5]。越来越多的证据表明，由神经元离断或坐骨神经慢性结扎所造成的神经病理性痛觉模型，或炎症痛模型可引起初级感觉神经元上钠通道表达和分布的改变[6，7]。最近的研究表明，用痛敏原处理小直径DRG神经元可导致其上TTX-R钠电流的增加[8～10]，同时有实验证实，主要表达在小直径DRG神经元上产生TTX-R钠电流的两种同源钠通道rPN3和SNS，在慢性压榨引起的轴突损伤部位产生富集[11]。这些均提示由损伤导致的外周神经元的高敏感性与钠通道有关。临床资料也证明利多卡因等钠通道阻断剂在治疗慢性疼痛中疗效显著[12]。
, 百拇医药
本研究结果表明，BmK AS-1可明显抑制TTX-R钠电流的幅度，与其镇痛作用一致，其抑制作用也表现出浓度依赖性。我们可以推测，BmK AS-1通过抑制与痛觉传入密切相关的TTX-R钠通道的活性，影响痛觉传导神经元外周末梢的敏感性，从而发挥其外周镇痛作用。或者说，BmK AS-1对TTX-R钠通道电流的抑制作用是其镇痛作用的可能机理之一。
国家自然科学基金(39870702)，国家新药研究基金(96-901-05-208)，江苏省自然科学基金(BK95076301)资助项目
参考文献
1，肖 杭，毛 霞，谭智勇，等.东亚钳蝎毒素多肽BmK AS-1对大鼠皮肤痛觉的影响.中国药理学与毒理学杂志，修回中
2，Liu Y, Ren HM, Ji YH, et al. Purification and the partial amino acid sequence of a novel activator of ryanodine receptor (BmK AS-1) from mammalian skeletal muscle. Biomedical Res, 1996,17:451
, http://www.100md.com
3，Ji YH, Li YJ, Zhang JW, et al. Covalent structures of BmK AS and BmK AS-1, two novel bioactive polypeptides purified from Chinese scorpion Buthus martensi karsch. Toxicon, 1999,37:519
4，Treede RD. Transmission properties of primary nociceptive afferents. Ross Fiziol ZH Im I M Sechenova, 1999,85(1):205
5，刘安西，陈守同编译.细胞膜离子通道.北京：中央民族学院出版社，1990.1～3
6，Michsel JC, Matk AS, Makoto T, et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature, 1997,389(23):816
, 百拇医药
7，Dib-Hajj S, Black JA, Felts P, et al. Downregulation of transcripts for Na channel alpha-SNS in spinal sensory neurons following axotomy. Proc Natl Acad Sci, 1999,93:14950
8，Michael SG, David BR, Michawl JS, et al. Hyperalgesic agents increase a tetrodotoxin-resistant Na+ current in nociceptors. Proc Natl Acad Sci, 1996,93:1108
9，Gould HJ, Gould YN, Paul D, et al. Development of inflammatory hypersensitivity and augmentation of sodium channels in rat dorsal root ganglia. Brain Research, 1999,824:296
, 百拇医药
10，Armen NA, Lucia S, John NW. A tetrodotoxin-resistant voltage-gated sodium channel expressed by sensory neurons. Nature, 1996,379(18):257
11，Novakovic SD, Tzoumaka E, Mcgivern JG, et al. Distribution of the tetrodotoxin-resistant sodium channel PN3 in rat sensory neurons in normal and neuropathic conditions. J Neurosci, 1998,18(6):2174
12，Tanelian DL, Victory RA. Sodium channel blocking agents: their use in neuropathic pain conditions. Pain Forum, 1995,4:75
(1999-12-14收稿)
, 百拇医药