不同稀释度显色剂对糖化蛋白亲和层析法的影响
作者：陈丹 黄春 张安 朱田凤
单位：陈丹( 广东省湛江中心人民医院 内分泌科，湛江 524037)；黄春( 广东省湛江中心人民医院 内分泌科，湛江 524037)；张安( 广东省湛江中心人民医院 检验科，湛江 524037)；朱田凤( 广东省湛江中心人民医院 检验科，湛江 524037)
关键词：糖化蛋白；亲和层析法；显色
广东医学院学报000222 摘要 目的：通过对糖化蛋白的显色剂 的不同稀释度进行选择性、显色稳定及重复 性试验，探讨其显色灵敏性。方法：采用对糖基有亲和作用的层析 柱将糖 化蛋白与非糖化蛋白的分开利用不同显色剂使白蛋白和总蛋白得以显色。结果 ：对原法显色剂稀释度由1∶4改为1∶30，提高了显色的稳定性及吸光度的 灵敏度。结论：原法总蛋白显色剂1∶4，其吸光度超 过1.0，影响吸光度灵敏性，改为1∶30稀释度，符合吸光度灵敏性要求范围。
, 百拇医药
文章编号：1005-4057 (2000) 02-0167-02
糖化血清蛋白的测定可准确反映患者在血清半衰期内平均血糖变化情况 ，可作为患者控制病情近期指标[1]。笔者在使用试剂进行糖化血清蛋白测定过程 中，发现 原法操作介绍中，总蛋白显色B稀释度1∶4不符合比色要求，颜色太浓，吸光度 超过1.0，影响吸光度灵敏度。为了提高测定结果的可靠性，本文对其测定方法 中的显色部分进行探讨，现报道如下：
1 材料与方法
1.1仪器
721分光光度计(上海第三仪器厂生产。)
1.2 层析微柱
北京市富瑞达商贸中心生物技术开发部糖化蛋白测定试剂盒。
, 百拇医药
1.3 方法
取50 μL血清加于微柱内树脂床上，待血清完全进入树脂床后将柱移至试管上， 滴入洗脱液Ⅲ号100 uL收集洗脱液，然后再加洗脱液Ⅲ号2.9 mL收集在 试管内(第1管)，收集完毕将柱移至第2管 上，加入洗脱液Ⅳ号2 mL，收集洗脱液。第1管洗脱液为非糖化部分(N)， 第2管为糖化部分(G)。加蒸馏水7 mL至第1管中。充分混合后，于两管各 取100 μL分别置于试管中，再各加入2 mL显色剂B混合在630 nm 波长下测定吸光度。
2 结果
2.1 总蛋白显色剂稀释度试验
将总蛋白显色B从1∶5至1∶40进行稀释，然后按操作进行显色15 min 后比色，读取吸光度，结果见表1。
表1 显色剂B不同稀释度的 吸光度 显色剂B稀释度
, 百拇医药
1∶5
1∶10
1∶1 5
1∶20
1∶25
1∶30
1∶35
1∶40
N相应吸光度
1.030
0.852
0.730
0.630
, http://www.100md.com
0.44 0
0.360
0.355
0.260
G相应吸光度
0.976
0.820
0.703
0.60 1
0.415
0.317
0.290
0.253
, 百拇医药
N为非糖化总蛋白，G为糖化总蛋白
2.2 反应显色后稳定性试验
取一份标本按操作进行，在总蛋白显色后每隔5～10 min，读取吸光度1次， 在20～60 min内显色基本稳定。
2.3 重复性试验
用高值和正常值标本各1份按上述操作(B显色剂稀释1∶30)，做批内与批间 试验，结果见表2。表2 高值和正常值批内、批间试验结果
批 内
批 间
n
, 百拇医药 s
CV
n
s
CV
高值标本
20
0.1135
0.00 24
2.1%
20
0.125
, 百拇医药
0.042
4.2%
正常值标本
20
0.778
0.0033
0.3%
20
0.0833
0.0534
4.0%
3 讨论
糖尿病是危害人类健康的常见病之一，长期监控血糖是治疗糖尿病的重要手段[1] ，糖化蛋白(包括糖化白蛋白GA，糖化总蛋白GTP)是由蛋白中的赖氨酸残基与 葡萄糖非酶缩合形成，是蛋白在葡葡糖介质中普遍发生的反应[2]。在人体中， 血清蛋白能与葡萄糖不断结合，并随血糖浓度变化而变化[3]血清蛋白的半衰期 约1～3周，因此其测定可有效反映患者近期(1～3周)内平均血糖水平，作为 患者控制病情近期指标，更好指导临床用药。
, 百拇医药
本法采用亲和色谱柱内氨基苯硼酸琼脂糖硼酸基对血清中非酶性糖化蛋白中的顺式 二糖酸有高度亲和力，能够吸附糖化蛋白的特性通过不同洗脱液将糖化蛋白与非糖 化蛋白分开[4]，利用不同显色剂使白蛋白和总蛋白得以显色。分光光度计测定 其吸光度。
在对总蛋白显色剂稀释度试验中，从稀释1∶5至1∶40，其中1∶30稀释度 其相应吸光度N＝0.360，G＝0.317符合吸光度的灵敏度要求范围，较 其他稀释度为最适宜[5]。在显色稳定试验中，也选用稀释度为1∶30显色剂 每陋5 min进行显色，使其在20～60 min吸光度不变，保持显色稳定 性，使总蛋白的测定误差减少。另取1份高值糖化总蛋白标本批内重复20次，变 异系数CV＝2.1%，批间CV＝4.2%，表明显色剂稀释度为1∶30时， 其批内和批间变异系数均符合检验要求，重复性好。
在本法上述各项试验中，把糖化总蛋白显色剂稀释度由1∶4改为1∶30，使总 蛋白显色稳定可靠，更好反映2～3周内血糖水平，对糖尿病患者的血糖控制及了 解某些慢性并发症的发生，有一定临床价值[6]。本法具有简易、微量、稳定、 准确等特点，适宜一般实验室使用。
, http://www.100md.com
作者简介：陈丹，女，1964年2月出生，学士，主治医师
参考文献
[1] 任秀红，南冀萍，张志利.糖化血红蛋白测定的临床应用.中国糖尿 病杂志，1996，4(4)：238～239
[2] 路面春，李其巨.比色测定血清果糖胺的实验研究.临床检验杂志，199 0，8(1)：7
[3] 魏明意，苏子林.血清果糖分析的方法和应用.中华医学检验杂志，198 8，11(2)：69
[4] 杨晋德，张锋.四氮唑蓝比色法测定血清糖化白蛋白.临床检验杂志，19 97，15(3)：148
[5] 李洪臣.维生素C对血清果糖胺测定的干扰.临床检验杂志，1993，1 1(2)：82
[6] 杨秀芳，俞茂华，钱弘侃，等.糖基化指甲蛋白、血浆蛋白及血红蛋白的测定 法.临床检验杂志，1990，8(1)：18～19
收稿日期：1999-11-09；修订日期：2000-03-20, http://www.100md.com
单位：陈丹( 广东省湛江中心人民医院 内分泌科，湛江 524037)；黄春( 广东省湛江中心人民医院 内分泌科，湛江 524037)；张安( 广东省湛江中心人民医院 检验科，湛江 524037)；朱田凤( 广东省湛江中心人民医院 检验科，湛江 524037)
关键词：糖化蛋白；亲和层析法；显色
广东医学院学报000222 摘要 目的：通过对糖化蛋白的显色剂 的不同稀释度进行选择性、显色稳定及重复 性试验，探讨其显色灵敏性。方法：采用对糖基有亲和作用的层析 柱将糖 化蛋白与非糖化蛋白的分开利用不同显色剂使白蛋白和总蛋白得以显色。结果 ：对原法显色剂稀释度由1∶4改为1∶30，提高了显色的稳定性及吸光度的 灵敏度。结论：原法总蛋白显色剂1∶4，其吸光度超 过1.0，影响吸光度灵敏性，改为1∶30稀释度，符合吸光度灵敏性要求范围。
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文章编号：1005-4057 (2000) 02-0167-02
糖化血清蛋白的测定可准确反映患者在血清半衰期内平均血糖变化情况 ，可作为患者控制病情近期指标[1]。笔者在使用试剂进行糖化血清蛋白测定过程 中，发现 原法操作介绍中，总蛋白显色B稀释度1∶4不符合比色要求，颜色太浓，吸光度 超过1.0，影响吸光度灵敏度。为了提高测定结果的可靠性，本文对其测定方法 中的显色部分进行探讨，现报道如下：
1 材料与方法
1.1仪器
721分光光度计(上海第三仪器厂生产。)
1.2 层析微柱
北京市富瑞达商贸中心生物技术开发部糖化蛋白测定试剂盒。
, 百拇医药
1.3 方法
取50 μL血清加于微柱内树脂床上，待血清完全进入树脂床后将柱移至试管上， 滴入洗脱液Ⅲ号100 uL收集洗脱液，然后再加洗脱液Ⅲ号2.9 mL收集在 试管内(第1管)，收集完毕将柱移至第2管 上，加入洗脱液Ⅳ号2 mL，收集洗脱液。第1管洗脱液为非糖化部分(N)， 第2管为糖化部分(G)。加蒸馏水7 mL至第1管中。充分混合后，于两管各 取100 μL分别置于试管中，再各加入2 mL显色剂B混合在630 nm 波长下测定吸光度。
2 结果
2.1 总蛋白显色剂稀释度试验
将总蛋白显色B从1∶5至1∶40进行稀释，然后按操作进行显色15 min 后比色，读取吸光度，结果见表1。
表1 显色剂B不同稀释度的 吸光度 显色剂B稀释度
, 百拇医药
1∶5
1∶10
1∶1 5
1∶20
1∶25
1∶30
1∶35
1∶40
N相应吸光度
1.030
0.852
0.730
0.630
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0.44 0
0.360
0.355
0.260
G相应吸光度
0.976
0.820
0.703
0.60 1
0.415
0.317
0.290
0.253
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N为非糖化总蛋白，G为糖化总蛋白
2.2 反应显色后稳定性试验
取一份标本按操作进行，在总蛋白显色后每隔5～10 min，读取吸光度1次， 在20～60 min内显色基本稳定。
2.3 重复性试验
用高值和正常值标本各1份按上述操作(B显色剂稀释1∶30)，做批内与批间 试验，结果见表2。表2 高值和正常值批内、批间试验结果
批 内
批 间
n
, 百拇医药 s
CV
n
s
CV
高值标本
20
0.1135
0.00 24
2.1%
20
0.125
, 百拇医药
0.042
4.2%
正常值标本
20
0.778
0.0033
0.3%
20
0.0833
0.0534
4.0%
3 讨论
糖尿病是危害人类健康的常见病之一，长期监控血糖是治疗糖尿病的重要手段[1] ，糖化蛋白(包括糖化白蛋白GA，糖化总蛋白GTP)是由蛋白中的赖氨酸残基与 葡萄糖非酶缩合形成，是蛋白在葡葡糖介质中普遍发生的反应[2]。在人体中， 血清蛋白能与葡萄糖不断结合，并随血糖浓度变化而变化[3]血清蛋白的半衰期 约1～3周，因此其测定可有效反映患者近期(1～3周)内平均血糖水平，作为 患者控制病情近期指标，更好指导临床用药。
, 百拇医药
本法采用亲和色谱柱内氨基苯硼酸琼脂糖硼酸基对血清中非酶性糖化蛋白中的顺式 二糖酸有高度亲和力，能够吸附糖化蛋白的特性通过不同洗脱液将糖化蛋白与非糖 化蛋白分开[4]，利用不同显色剂使白蛋白和总蛋白得以显色。分光光度计测定 其吸光度。
在对总蛋白显色剂稀释度试验中，从稀释1∶5至1∶40，其中1∶30稀释度 其相应吸光度N＝0.360，G＝0.317符合吸光度的灵敏度要求范围，较 其他稀释度为最适宜[5]。在显色稳定试验中，也选用稀释度为1∶30显色剂 每陋5 min进行显色，使其在20～60 min吸光度不变，保持显色稳定 性，使总蛋白的测定误差减少。另取1份高值糖化总蛋白标本批内重复20次，变 异系数CV＝2.1%，批间CV＝4.2%，表明显色剂稀释度为1∶30时， 其批内和批间变异系数均符合检验要求，重复性好。
在本法上述各项试验中，把糖化总蛋白显色剂稀释度由1∶4改为1∶30，使总 蛋白显色稳定可靠，更好反映2～3周内血糖水平，对糖尿病患者的血糖控制及了 解某些慢性并发症的发生，有一定临床价值[6]。本法具有简易、微量、稳定、 准确等特点，适宜一般实验室使用。
, http://www.100md.com
作者简介：陈丹，女，1964年2月出生，学士，主治医师
参考文献
[1] 任秀红，南冀萍，张志利.糖化血红蛋白测定的临床应用.中国糖尿 病杂志，1996，4(4)：238～239
[2] 路面春，李其巨.比色测定血清果糖胺的实验研究.临床检验杂志，199 0，8(1)：7
[3] 魏明意，苏子林.血清果糖分析的方法和应用.中华医学检验杂志，198 8，11(2)：69
[4] 杨晋德，张锋.四氮唑蓝比色法测定血清糖化白蛋白.临床检验杂志，19 97，15(3)：148
[5] 李洪臣.维生素C对血清果糖胺测定的干扰.临床检验杂志，1993，1 1(2)：82
[6] 杨秀芳，俞茂华，钱弘侃，等.糖基化指甲蛋白、血浆蛋白及血红蛋白的测定 法.临床检验杂志，1990，8(1)：18～19
收稿日期：1999-11-09；修订日期：2000-03-20, http://www.100md.com