Propentofylline 对中性粒细胞的调节作用
作者:张煜 巴图
单位:白求恩医科大学,长春 130021
关键词:腺苷;Propentofylline;过氧化氢
中国临床药理学杂志000115
摘 要:本研究探讨Propentofylline对中性粒细胞的调节作用及其它的作用机制。采用鲁米诺依赖的全血化学发光法测定fMLP激活的中性粒细胞产生过氧化氢。结果显示Propentofylline以浓度依赖形式抑制中性粒细胞产生过氧化氢,并增强腺苷对中性粒细胞的抑制作用,但不影响NECA对中性粒细胞的抑制作用。结果提示,Propentofylline通过抑制细胞对腺苷的摄取,增加局部腺苷水平,增强腺苷对中性粒细胞的抑制作用。这种作用也可能是Propentofylline保护心脑组织损伤的机制之一。
The Effects of Propentofylline on Human Neutrophils
, http://www.100md.com
ZHANG Yu BA Tu
(Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021)
Abstract:In this study, we tested the effects and mechanisms of propentofylline on human neutrophils. The neutrophils were stimulated by fMLP (formyl-MetLeuPhe) and hydrogen peroxide was determined by the luminol amplified chemiluminescence. Results showned that propentofylline inhibited the hydrogen peroxide production by neutrophils in concentration-dependent manner. The inhibitory effect of adenosine on fMLP-stimulated neutrophil hydrogen peroxide was markedly increased in the presence of propentofylline. But that of NECA (5`-N-ethylcarboxamidoadenosine) was unaffected, indicated that the inhibitory effect of propentofylline on neutrophils was mediated by inhibiting adenosine uptake and increasing the local concentration of adenosine. This effect could be a mechanism of the protective effects of propentofylline on the ischemia of brain and heart.
, 百拇医药
Key words:adenosine;propentofylline;hydrogen peroxide
Propentofylline,是新的黄嘌呤衍生物,已经显示对心脑组织缺血具有保护作用,机制可能与其扩张血管,增加能量恢复及降低脑组织水肿有关[1]。由于中性粒细胞在组织缺血再灌注损伤中起着重要的作用,因此,我们研究了Propentofylline 对中性粒细胞的调节作用及其它的作用机制。用甲酰基-甲硫氨基-亮氨酰基-苯丙氨酸(fMLP)激活中性粒细胞,采用鲁米诺反应测量中性粒细胞产生的过氧化氢含量。
材料和方法
1.试剂
腺苷或其衍生物N-已基-羧酰氨基腺苷(NECA)的浓度为0.01, 0.1, 1, 10 μmol.L-1。 Propentofylline的浓度为10, 30, 100, 300, 1000μmol.L-1。Hank 平衡盐溶液。细胞激化剂(fMLP)1μmol.L-1。
, http://www.100md.com
2. 测定方法
2.1 中性粒细胞的分离
取健康成年人血30~50 ml,肝素抗凝, 用Percoll细胞分离液分离细胞,参照Wright法[2]进行,离心后收集中性粒细胞,用PBS冲洗二次,蒸溜水溶解污染的红细胞。冲洗后的细胞再用Hank 平衡盐溶液配成理想的浓度1×106/ml,计数所得细胞,以中性粒细胞比例>90%(革兰染色)及细胞活力>95%(台盼蓝拒染)为合格。
2.2 过氧化氢的测定
采用鲁米诺依赖的全血化学发光法(CL) 参照Wymann法[3]进行,这是测定中性粒细胞呼吸爆发非常敏感的方法。不同浓度的药物加到含中性粒细胞的试管中,在37°C条件下水浴5 min后,fMLP激活细胞,细胞释放的CL用Luminometer测定。CL峰值代表中性粒细胞产生过氧化氢的量。数据表达采用与对照组的百分比。所有药物在无细胞情况下均不影响鲁米诺系统。
, 百拇医药
2.3 统计学处理
所有数据均为平均值和标准差,来源于4~8个试验。显著性差异用t检验方法测定。
结果
1. Propentofylline 对中性粒细胞的调节作用
Propentofylline抑制中性粒细胞产生过氧化氢,表现为浓度依赖性抑制,随着浓度的增加,抑制作用增强(见图和表1)。
Table1.The effect of propentofylline on hydrogen
proxide in fMLP-stimulated neutropjils(mean±SD,n=4) Concentration(μmol.L-1)
, http://www.100md.com
0
10
30
100
300
1000
mean±SD
100±9.0
90.2±14.5
81.7±12.5
54.1±18.9
47.7±15.6
24.7±9.3
, http://www.100md.com
Fig1.The effect of propentofylline on hydrogen proxidein fMLP-stimulated neutrophils.
2. Propentofylline 对腺苷作用的影响
腺苷和NECA均抑制中性粒细胞产生过氧化氢。并随着浓度的增加其抑制作用增强。低浓度的Propentofylline (1μmol.L-1)不影响腺苷对中性粒细胞的作用(数据未显示),而高浓度的Propentofylline (100μmol.L-1)明显增强腺苷对中性粒细胞的抑制作用P<0.05,最大抑制率由66%升到81%。然而,NECA对中性粒细胞的抑制作用不受Propentofylline 的影响p>0.05(见表2)。
Table2.The effects of adenosine and NEDA on hydrogen proxide production in the presence
, 百拇医药
or absence of propentofylline(mean±SD,n=8) Group
Concentration(μg.L-1)
0
0.01
0.1
1
10
Adenosine
100±7.5
94.2±10.6
80.1±9.1
, http://www.100md.com
45.4±7.7
34.4±5.3
+PPF1000
(μmol.L-1)
92.8±8.9
62.9±7.5*
24.5±4.3*
20.6±3.2
NECA
100±5.4
90.5±7.2
, 百拇医药
67.7±7.4
38.1±4.7
26.6±4.0
+PPF100
(μmol.L-1)
84.7±15.3
63.5±15.2
43.6±7.8
29.8±5.5
讨论
组织缺血激活中性粒细胞产生大量氧自由基,与细胞膜上的脂质结合,引起细胞膜功能失调,导致细胞内钙超载,细胞死亡[4]。缺血也刺激腺苷的产生,现已证实,腺苷抑制中性粒细胞粘附到内皮细胞,降低氧自由基释放。血管内皮细胞通过释放腺苷阻止激活白细胞对内皮细胞的损伤[5]。然而,由于外源性腺苷对心血管系统严重的副作用,如低血压和窦性心动过缓,临床应用受到限制。近年来研究趋于促进内源性腺苷的产生或抑制细胞对腺苷的摄取,利用内源性腺苷发挥作用。
, http://www.100md.com
与以往的报道相同,腺苷抑制fMLP激活的中性粒细胞产生过氧化氢。Propentofylline增强腺苷对中性粒细胞的抑制作用,但不影响NECA对中性粒细胞的抑制作用。这与脑组织研究结果类似,在那里,Propentofylline 增加腺苷所引起的cAMP水平,却不影响NECA所引起的cAMP水平,表明Propentofylline发挥作用在腺苷受体激活以前。因为NECA与腺苷代谢途径不同, 机制可能象文献报道的那样,Propentofylline抑制细胞对腺苷的摄取,增加局部腺苷的浓度所致[6]。
腺苷通过其受体发挥作用,腺苷A2受体通过细胞膜上的Gs蛋白兴奋腺苷环化酶使细胞内的ATP变成cAMP, cAMP在磷酸二酯酶的作用下形成5誂MP。cAMP是细胞内重要的第二信使,cAMP通过蛋白激酶A,使细胞发生反应。Propentofylline也是磷酸二酯酶抑制剂[7],可以推测Propentofylline可能通过增加cAMP浓度增加腺苷对中性粒细胞的抑制作用。
, 百拇医药
结论:Propentofylline抑制中性粒细胞产生过氧化氢,可能的机制通过抑制细胞对腺苷的摄取,增加局部腺苷的水平,发挥腺苷的作用。这也可能是它保护心脑组织缺血性损伤的机制之一。
参考文献
1.Hofmann W,Gojowczy KG and Stefanovich V. Effects of a xanthine derivative, propentofylline, on local cerebral blood flow and glucose utilization in the rat. Brain Res, 1996; 740:41~46.
2.Wright DG. Human neutrophils degranulation. Methods Enzymol,1988; 162: 538~543.
, 百拇医药
3. Wymann MP, von Tscharner V, Deranleau DA et al.Chemiluminescence detection of H2O2 produced by human neutrophils during the respiratory burst. Anal Biochem, 1987; 165: 371~378.
4.Ambrosio G and Chiariello M. .Myocardial reperfusion injury:mechanisms and management. A review. Am J Med, 1991; 91(Suppl3c):86~95.
5.Zhang Y, Polmblad J and Fredholm BB. Biphasic effect of ATP on neutrophil functions mediated by P2u and adenosine A2a receptors.Biochemical Pharmacology, 1996; 51: 957~965.
, 百拇医药
6.Parkinson FE, Rudolphi KA, Fredholm BB. Propentofylline: a nucleoside transport inhibitor with neuroprotective effects in cerebral ischemia. Gen-Pharmacol, 1994; 25: 1053~1058.
7.Fredholm BB and Lindtrom K. The xanthine derivative 1-(5'-oxohexxyl)-3-methy-7-propy) xanthine (HWA 285) enhances the action of adenosine.Acta Pharmacol Toxicol, 1986; 58: 187~192.
收稿:1999-4-6
修回:1999-11-5, 百拇医药
单位:白求恩医科大学,长春 130021
关键词:腺苷;Propentofylline;过氧化氢
中国临床药理学杂志000115
摘 要:本研究探讨Propentofylline对中性粒细胞的调节作用及其它的作用机制。采用鲁米诺依赖的全血化学发光法测定fMLP激活的中性粒细胞产生过氧化氢。结果显示Propentofylline以浓度依赖形式抑制中性粒细胞产生过氧化氢,并增强腺苷对中性粒细胞的抑制作用,但不影响NECA对中性粒细胞的抑制作用。结果提示,Propentofylline通过抑制细胞对腺苷的摄取,增加局部腺苷水平,增强腺苷对中性粒细胞的抑制作用。这种作用也可能是Propentofylline保护心脑组织损伤的机制之一。
The Effects of Propentofylline on Human Neutrophils
, http://www.100md.com
ZHANG Yu BA Tu
(Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021)
Abstract:In this study, we tested the effects and mechanisms of propentofylline on human neutrophils. The neutrophils were stimulated by fMLP (formyl-MetLeuPhe) and hydrogen peroxide was determined by the luminol amplified chemiluminescence. Results showned that propentofylline inhibited the hydrogen peroxide production by neutrophils in concentration-dependent manner. The inhibitory effect of adenosine on fMLP-stimulated neutrophil hydrogen peroxide was markedly increased in the presence of propentofylline. But that of NECA (5`-N-ethylcarboxamidoadenosine) was unaffected, indicated that the inhibitory effect of propentofylline on neutrophils was mediated by inhibiting adenosine uptake and increasing the local concentration of adenosine. This effect could be a mechanism of the protective effects of propentofylline on the ischemia of brain and heart.
, 百拇医药
Key words:adenosine;propentofylline;hydrogen peroxide
Propentofylline,是新的黄嘌呤衍生物,已经显示对心脑组织缺血具有保护作用,机制可能与其扩张血管,增加能量恢复及降低脑组织水肿有关[1]。由于中性粒细胞在组织缺血再灌注损伤中起着重要的作用,因此,我们研究了Propentofylline 对中性粒细胞的调节作用及其它的作用机制。用甲酰基-甲硫氨基-亮氨酰基-苯丙氨酸(fMLP)激活中性粒细胞,采用鲁米诺反应测量中性粒细胞产生的过氧化氢含量。
材料和方法
1.试剂
腺苷或其衍生物N-已基-羧酰氨基腺苷(NECA)的浓度为0.01, 0.1, 1, 10 μmol.L-1。 Propentofylline的浓度为10, 30, 100, 300, 1000μmol.L-1。Hank 平衡盐溶液。细胞激化剂(fMLP)1μmol.L-1。
, http://www.100md.com
2. 测定方法
2.1 中性粒细胞的分离
取健康成年人血30~50 ml,肝素抗凝, 用Percoll细胞分离液分离细胞,参照Wright法[2]进行,离心后收集中性粒细胞,用PBS冲洗二次,蒸溜水溶解污染的红细胞。冲洗后的细胞再用Hank 平衡盐溶液配成理想的浓度1×106/ml,计数所得细胞,以中性粒细胞比例>90%(革兰染色)及细胞活力>95%(台盼蓝拒染)为合格。
2.2 过氧化氢的测定
采用鲁米诺依赖的全血化学发光法(CL) 参照Wymann法[3]进行,这是测定中性粒细胞呼吸爆发非常敏感的方法。不同浓度的药物加到含中性粒细胞的试管中,在37°C条件下水浴5 min后,fMLP激活细胞,细胞释放的CL用Luminometer测定。CL峰值代表中性粒细胞产生过氧化氢的量。数据表达采用与对照组的百分比。所有药物在无细胞情况下均不影响鲁米诺系统。
, 百拇医药
2.3 统计学处理
所有数据均为平均值和标准差,来源于4~8个试验。显著性差异用t检验方法测定。
结果
1. Propentofylline 对中性粒细胞的调节作用
Propentofylline抑制中性粒细胞产生过氧化氢,表现为浓度依赖性抑制,随着浓度的增加,抑制作用增强(见图和表1)。
Table1.The effect of propentofylline on hydrogen
proxide in fMLP-stimulated neutropjils(mean±SD,n=4) Concentration(μmol.L-1)
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0
10
30
100
300
1000
mean±SD
100±9.0
90.2±14.5
81.7±12.5
54.1±18.9
47.7±15.6
24.7±9.3
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Fig1.The effect of propentofylline on hydrogen proxidein fMLP-stimulated neutrophils.
2. Propentofylline 对腺苷作用的影响
腺苷和NECA均抑制中性粒细胞产生过氧化氢。并随着浓度的增加其抑制作用增强。低浓度的Propentofylline (1μmol.L-1)不影响腺苷对中性粒细胞的作用(数据未显示),而高浓度的Propentofylline (100μmol.L-1)明显增强腺苷对中性粒细胞的抑制作用P<0.05,最大抑制率由66%升到81%。然而,NECA对中性粒细胞的抑制作用不受Propentofylline 的影响p>0.05(见表2)。
Table2.The effects of adenosine and NEDA on hydrogen proxide production in the presence
, 百拇医药
or absence of propentofylline(mean±SD,n=8) Group
Concentration(μg.L-1)
0
0.01
0.1
1
10
Adenosine
100±7.5
94.2±10.6
80.1±9.1
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45.4±7.7
34.4±5.3
+PPF1000
(μmol.L-1)
92.8±8.9
62.9±7.5*
24.5±4.3*
20.6±3.2
NECA
100±5.4
90.5±7.2
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67.7±7.4
38.1±4.7
26.6±4.0
+PPF100
(μmol.L-1)
84.7±15.3
63.5±15.2
43.6±7.8
29.8±5.5
讨论
组织缺血激活中性粒细胞产生大量氧自由基,与细胞膜上的脂质结合,引起细胞膜功能失调,导致细胞内钙超载,细胞死亡[4]。缺血也刺激腺苷的产生,现已证实,腺苷抑制中性粒细胞粘附到内皮细胞,降低氧自由基释放。血管内皮细胞通过释放腺苷阻止激活白细胞对内皮细胞的损伤[5]。然而,由于外源性腺苷对心血管系统严重的副作用,如低血压和窦性心动过缓,临床应用受到限制。近年来研究趋于促进内源性腺苷的产生或抑制细胞对腺苷的摄取,利用内源性腺苷发挥作用。
, http://www.100md.com
与以往的报道相同,腺苷抑制fMLP激活的中性粒细胞产生过氧化氢。Propentofylline增强腺苷对中性粒细胞的抑制作用,但不影响NECA对中性粒细胞的抑制作用。这与脑组织研究结果类似,在那里,Propentofylline 增加腺苷所引起的cAMP水平,却不影响NECA所引起的cAMP水平,表明Propentofylline发挥作用在腺苷受体激活以前。因为NECA与腺苷代谢途径不同, 机制可能象文献报道的那样,Propentofylline抑制细胞对腺苷的摄取,增加局部腺苷的浓度所致[6]。
腺苷通过其受体发挥作用,腺苷A2受体通过细胞膜上的Gs蛋白兴奋腺苷环化酶使细胞内的ATP变成cAMP, cAMP在磷酸二酯酶的作用下形成5誂MP。cAMP是细胞内重要的第二信使,cAMP通过蛋白激酶A,使细胞发生反应。Propentofylline也是磷酸二酯酶抑制剂[7],可以推测Propentofylline可能通过增加cAMP浓度增加腺苷对中性粒细胞的抑制作用。
, 百拇医药
结论:Propentofylline抑制中性粒细胞产生过氧化氢,可能的机制通过抑制细胞对腺苷的摄取,增加局部腺苷的水平,发挥腺苷的作用。这也可能是它保护心脑组织缺血性损伤的机制之一。
参考文献
1.Hofmann W,Gojowczy KG and Stefanovich V. Effects of a xanthine derivative, propentofylline, on local cerebral blood flow and glucose utilization in the rat. Brain Res, 1996; 740:41~46.
2.Wright DG. Human neutrophils degranulation. Methods Enzymol,1988; 162: 538~543.
, 百拇医药
3. Wymann MP, von Tscharner V, Deranleau DA et al.Chemiluminescence detection of H2O2 produced by human neutrophils during the respiratory burst. Anal Biochem, 1987; 165: 371~378.
4.Ambrosio G and Chiariello M. .Myocardial reperfusion injury:mechanisms and management. A review. Am J Med, 1991; 91(Suppl3c):86~95.
5.Zhang Y, Polmblad J and Fredholm BB. Biphasic effect of ATP on neutrophil functions mediated by P2u and adenosine A2a receptors.Biochemical Pharmacology, 1996; 51: 957~965.
, 百拇医药
6.Parkinson FE, Rudolphi KA, Fredholm BB. Propentofylline: a nucleoside transport inhibitor with neuroprotective effects in cerebral ischemia. Gen-Pharmacol, 1994; 25: 1053~1058.
7.Fredholm BB and Lindtrom K. The xanthine derivative 1-(5'-oxohexxyl)-3-methy-7-propy) xanthine (HWA 285) enhances the action of adenosine.Acta Pharmacol Toxicol, 1986; 58: 187~192.
收稿:1999-4-6
修回:1999-11-5, 百拇医药