生物波调控因子生物作用检测方法研究
作者：徐启旺 袁泽涛 王源 刘俊康 刘美良
单位：(第三军医大学 生物波研究中心，重庆 400038)
关键词：生物波；奇异变形杆菌
生物医学工程学杂志000229 摘要 为建立生物波调控因子生物作用 检测方法，采用分析微生物学方法，以奇异变形杆菌建立实验模型，对细菌波动培养过程中 获得的生物波调控因子，进行了生物作用试验观察。结果确定了群体细菌波动生长过程中生 物波调控因子的存在及其可以使生物波波环增加和生物波周期缩短的作用，这一检测方法的 建立在研究生物波的调控机制中有一定的价值。
A Study on the Determination Method of Biological Function of BRF
Xu Qiwang Yuan Zetao Wang Yuan Liu Junkang
, http://www.100md.com
(Research Center of Biological Wave, Third Military Medical Unviersity, Chongqing 400038)
Abstract This study was aimed to establish a method for de termining the biological function of biological wave regulating factor (BRF). P roteus mirabilis was used to set up the experimental model. The biological funct ion of the component obtained from wave growth media beneath the bacterial colo ny rings resulting from bacterial proliferation was determined in biological wa ve test by analytically microbiological method. The results indicated that BRF c ould enhance biological wave and shorten its period. The method is of some value in studying the regulative mechanism of biological wave.
, 百拇医药
Key words Biological wave Proteus mirabilis
1 前 言
生物波实验研究选择奇异变形杆菌等建立实验模型。观察群体细菌节律性生长机制及生物学 意义[1]，研究表明细菌代谢导致所处环境中出现营养和废物的浓度梯度，同时细 菌对环境变化表现高度适应性，在生物学性状等方面发生改变以适应环境。在形态上，变成 不同于繁殖体的纤细状细胞，其长度可达到正常繁殖体的几倍甚至几十倍；在生理上表现为 代谢低下，有潜在繁殖能力而不出现明显增殖，这种细菌生长状态，我们称之为细菌的潜生 体[2]。微观上繁殖体与潜生体的交替变化，称为潜生序，在宏观上对应出现群体 细菌的波动生长特征，即TTC还原阳性反应(红色)和阴性反应(黄色)菌落环的交替出现。其 中除细菌代谢一般产物促进潜生序变化外，推测细菌在繁殖生长阶段向培养环境中还释放了一种物质，调节和促进群体细菌波动生长的作用，我们暂称之为生物波调控因子(Biologi cal wave regulating factor, BRF)。考虑到处在波动生长部位的细菌量相对较少，所产生 的BRF也很微量，因此采用传统方法对BRF的测定困难较大。为此，本文在BRF分离纯化成功 的基础上，以奇异变形杆菌进行实验建立其生物作用检测方法。
, 百拇医药
2 材料与主要方法
2.1 菌种
奇异变形杆菌，本室分离鉴定，生物学性状稳定。
2.2 波动培养基(%)
胰蛋白胨1.0，酵母提取物0.5，氧化钠1.0，葡萄糖0.1；2,4,6-三苯基四氮唑(TTC)0. 05，琼脂1.5，pH7.2。
2.3 奇异变形杆菌波动培养方法
波动培养基中心点种奇异变形杆菌，置于本室改装波动孵箱培养，应达到的培养条件是相对 湿度40%，温度变化范围：31 ℃～39 ℃，持续时间1 h，通气量5 L/min。
2.4 BRF制备
, 百拇医药
将奇异变形杆菌波动生长形成的最外一道TTC反应阳性菌落环作为一个标本，环所在位置的 培养基取出，浸入生理盐水中，同样的方法分别收集20个标本，酸冻融后离心取上清。加入 浓盐酸制成10%盐酸溶液，封盖，置室温反应24 h后，用NaOH中和到pH7.0，Sephadex G-1 0( 购白华美生物工程公司)分离除盐后收集组份。60 ℃烤箱蒸发浓缩。用于分析微生物学 检测方法的试验。
3 结 果
3.1 生物波环增加试验
将收集的BRF组份，加入波动培养基中，在此培养基表面点种奇异变形杆菌，各接种点之间 距离相等，然后进行波动培养，培养24 h。对照组在波动培养基中加生理盐水，加入量及 培养条件同实验组，结果实验组培养基表面出现深红色的波动红环，每环宽度约2 mm，十分 清楚，从中心得到最外一环未发生递减迹象(如图1所示)，对照组培养基波动环红色较淡并 有递减现象，最外一环几乎看不到波动环(如图2)。
, 百拇医药
图1 生物波调控因子促波作用实验结果
Fig 1 Results of biological wave regulating factor(BRF) promoting wave gro wth of bacterial population
3.2 生物波周期缩短试验
方法同生物波环增加试验。采用适当稀释的BRF组分，加入波动培养基中，点种奇异变形杆 菌后经24 h培养，结果使每一红环上显现出很多微细波环，如图3，使环与环之间距离明 显缩短。在早期的研究工作中，提出微生物生长周期和波的概念[4]，以物理学 的方法测定奇异变形杆菌波动生长的周期为3 h，波长为1.3 mm。在培养基中加入BRF后， 该菌的波动生长特征发生改变，表现为周期明显缩短，波速显著提高。结果见表1：
表1 生物波周期缩短试验结果
, 百拇医药
Table 1 Results of BRF shortening wave growth period of bacterial popula tion
周期(h)
波长(mm)
波速(mm/h)
实验组
0.1
1.5
15
对照组
3
1.3
, 百拇医药
0.43
图2 无生物波调控因子对细菌波动生长结果
Fig 2 The growth pattern of bacterial population when cultured on the me dia without BRF
图3 生物波调控因子使群体细菌波动生长周期缩短试验 结果
Fig 3 Results of BRF shortening wave growth period of bacterial populat ion
4 讨 论
, 百拇医药
BRF的检测技术，目前仅限于生物分析这一方面，通过生物作用分析和对照实 验，间接检测到BRF的存在，这种检测方法的建立对研究生物波的调控机制有较大的帮助， 为生物波形成的自组织原理的实验找到了分析物质基础的实验条件。实验中，BRF促进细菌 波环增加表现为增强群体细菌还原TTC的能力，进而生成红色的菌落环。在细菌体内参与TTC 还原反应的物质主要是线粒体中的琥珀酸脱氢酶[6]，提示BRF可作用于琥珀酸脱氢 酶，影响其产量或活性，在促进细菌代谢方面有一定作用，这方面工作有待于进一步研究。
国家自然科学基金资助项目(39370008)
参考文献
1，刘俊康等.生物波理论的研究.中国微生态学杂志，1994；6(6)∶40
2，刘俊康，等.细菌潜生体增殖方式的观察研究.中华流行病学杂志，1996，17(3- C)∶134
3，王 源等.细菌胞外糖染色显微镜测定技术研究.中华医学检验杂志，1998；21 (1)∶1
4，徐启旺等.微生物生长的群体、周期和波.自然杂志，1992；15(3)∶195
5，李影林.临床微生物学检验.吉林科学技术出版社，吉林，1990∶199-200
(收稿：1998-12-08 修回：1999-06-22), http://www.100md.com
单位：(第三军医大学 生物波研究中心，重庆 400038)
关键词：生物波；奇异变形杆菌
生物医学工程学杂志000229 摘要 为建立生物波调控因子生物作用 检测方法，采用分析微生物学方法，以奇异变形杆菌建立实验模型，对细菌波动培养过程中 获得的生物波调控因子，进行了生物作用试验观察。结果确定了群体细菌波动生长过程中生 物波调控因子的存在及其可以使生物波波环增加和生物波周期缩短的作用，这一检测方法的 建立在研究生物波的调控机制中有一定的价值。
A Study on the Determination Method of Biological Function of BRF
Xu Qiwang Yuan Zetao Wang Yuan Liu Junkang
, http://www.100md.com
(Research Center of Biological Wave, Third Military Medical Unviersity, Chongqing 400038)
Abstract This study was aimed to establish a method for de termining the biological function of biological wave regulating factor (BRF). P roteus mirabilis was used to set up the experimental model. The biological funct ion of the component obtained from wave growth media beneath the bacterial colo ny rings resulting from bacterial proliferation was determined in biological wa ve test by analytically microbiological method. The results indicated that BRF c ould enhance biological wave and shorten its period. The method is of some value in studying the regulative mechanism of biological wave.
, 百拇医药
Key words Biological wave Proteus mirabilis
1 前 言
生物波实验研究选择奇异变形杆菌等建立实验模型。观察群体细菌节律性生长机制及生物学 意义[1]，研究表明细菌代谢导致所处环境中出现营养和废物的浓度梯度，同时细 菌对环境变化表现高度适应性，在生物学性状等方面发生改变以适应环境。在形态上，变成 不同于繁殖体的纤细状细胞，其长度可达到正常繁殖体的几倍甚至几十倍；在生理上表现为 代谢低下，有潜在繁殖能力而不出现明显增殖，这种细菌生长状态，我们称之为细菌的潜生 体[2]。微观上繁殖体与潜生体的交替变化，称为潜生序，在宏观上对应出现群体 细菌的波动生长特征，即TTC还原阳性反应(红色)和阴性反应(黄色)菌落环的交替出现。其 中除细菌代谢一般产物促进潜生序变化外，推测细菌在繁殖生长阶段向培养环境中还释放了一种物质，调节和促进群体细菌波动生长的作用，我们暂称之为生物波调控因子(Biologi cal wave regulating factor, BRF)。考虑到处在波动生长部位的细菌量相对较少，所产生 的BRF也很微量，因此采用传统方法对BRF的测定困难较大。为此，本文在BRF分离纯化成功 的基础上，以奇异变形杆菌进行实验建立其生物作用检测方法。
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2 材料与主要方法
2.1 菌种
奇异变形杆菌，本室分离鉴定，生物学性状稳定。
2.2 波动培养基(%)
胰蛋白胨1.0，酵母提取物0.5，氧化钠1.0，葡萄糖0.1；2,4,6-三苯基四氮唑(TTC)0. 05，琼脂1.5，pH7.2。
2.3 奇异变形杆菌波动培养方法
波动培养基中心点种奇异变形杆菌，置于本室改装波动孵箱培养，应达到的培养条件是相对 湿度40%，温度变化范围：31 ℃～39 ℃，持续时间1 h，通气量5 L/min。
2.4 BRF制备
, 百拇医药
将奇异变形杆菌波动生长形成的最外一道TTC反应阳性菌落环作为一个标本，环所在位置的 培养基取出，浸入生理盐水中，同样的方法分别收集20个标本，酸冻融后离心取上清。加入 浓盐酸制成10%盐酸溶液，封盖，置室温反应24 h后，用NaOH中和到pH7.0，Sephadex G-1 0( 购白华美生物工程公司)分离除盐后收集组份。60 ℃烤箱蒸发浓缩。用于分析微生物学 检测方法的试验。
3 结 果
3.1 生物波环增加试验
将收集的BRF组份，加入波动培养基中，在此培养基表面点种奇异变形杆菌，各接种点之间 距离相等，然后进行波动培养，培养24 h。对照组在波动培养基中加生理盐水，加入量及 培养条件同实验组，结果实验组培养基表面出现深红色的波动红环，每环宽度约2 mm，十分 清楚，从中心得到最外一环未发生递减迹象(如图1所示)，对照组培养基波动环红色较淡并 有递减现象，最外一环几乎看不到波动环(如图2)。
, 百拇医药
图1 生物波调控因子促波作用实验结果
Fig 1 Results of biological wave regulating factor(BRF) promoting wave gro wth of bacterial population
3.2 生物波周期缩短试验
方法同生物波环增加试验。采用适当稀释的BRF组分，加入波动培养基中，点种奇异变形杆 菌后经24 h培养，结果使每一红环上显现出很多微细波环，如图3，使环与环之间距离明 显缩短。在早期的研究工作中，提出微生物生长周期和波的概念[4]，以物理学 的方法测定奇异变形杆菌波动生长的周期为3 h，波长为1.3 mm。在培养基中加入BRF后， 该菌的波动生长特征发生改变，表现为周期明显缩短，波速显著提高。结果见表1：
表1 生物波周期缩短试验结果
, 百拇医药
Table 1 Results of BRF shortening wave growth period of bacterial popula tion
周期(h)
波长(mm)
波速(mm/h)
实验组
0.1
1.5
15
对照组
3
1.3
, 百拇医药
0.43
图2 无生物波调控因子对细菌波动生长结果
Fig 2 The growth pattern of bacterial population when cultured on the me dia without BRF
图3 生物波调控因子使群体细菌波动生长周期缩短试验 结果
Fig 3 Results of BRF shortening wave growth period of bacterial populat ion
4 讨 论
, 百拇医药
BRF的检测技术，目前仅限于生物分析这一方面，通过生物作用分析和对照实 验，间接检测到BRF的存在，这种检测方法的建立对研究生物波的调控机制有较大的帮助， 为生物波形成的自组织原理的实验找到了分析物质基础的实验条件。实验中，BRF促进细菌 波环增加表现为增强群体细菌还原TTC的能力，进而生成红色的菌落环。在细菌体内参与TTC 还原反应的物质主要是线粒体中的琥珀酸脱氢酶[6]，提示BRF可作用于琥珀酸脱氢 酶，影响其产量或活性，在促进细菌代谢方面有一定作用，这方面工作有待于进一步研究。
国家自然科学基金资助项目(39370008)
参考文献
1，刘俊康等.生物波理论的研究.中国微生态学杂志，1994；6(6)∶40
2，刘俊康，等.细菌潜生体增殖方式的观察研究.中华流行病学杂志，1996，17(3- C)∶134
3，王 源等.细菌胞外糖染色显微镜测定技术研究.中华医学检验杂志，1998；21 (1)∶1
4，徐启旺等.微生物生长的群体、周期和波.自然杂志，1992；15(3)∶195
5，李影林.临床微生物学检验.吉林科学技术出版社，吉林，1990∶199-200
(收稿：1998-12-08 修回：1999-06-22), http://www.100md.com