左旋多巴诱导PC12细胞凋亡及谷胱甘肽对细胞的保护作用
作者：韩燕 王洛伟 陈俊抛 杨玉庆 陈沛源
单位：陈俊抛(第一军医大学珠江医院神经内科，广东 广州 510282)；王洛伟(解放军海军医学研究所，上海 200433)陈俊抛 杨玉庆 陈沛源(解放军第456医院神经内科，山东 济南 250031)
关键词：左旋多巴；细胞系；谷胱甘肽；PC l2细胞
中国病理生理杂志000522
[摘 要] 目的:研究左旋多巴(L-dopa)对大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤(PC12)细胞的凋亡诱导作用并探讨其临床意义。方法:以PC12细胞为多巴胺(DA)神经元的细胞模型，利用电镜、DNA凝胶电泳结合图象分析仪、流式细胞术(FCM)等技术检测不同浓度L-dopa所致的凋亡率以及抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)对它的影响。结果:流式术测得50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L处理组凋亡率分别为12.4%、24.4%、37.2%，与琼脂糖电泳的片断化DNA比例基本一致，与对照组(2.3%)有显著差异(P<0.01)，L-dopa与GSH合用组凋亡率2.5%与对照组比较无显著差异(P>0.05)。结论:GSH可以阻断L-dopa 对PC12细胞的凋亡诱导作用，提示L-dopa 可能是通过氧化损害介导DA神经元凋亡，导致疗效减退。
, 百拇医药
[中图分类号] Q279 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0462-04
L-dopa induction of pheochromocytoma12 cells apoptosis and the protective function of glutathione
HAN Yan, CHEN Jun-pao, WANG Luo-wei, YANG Yu-qing, CHEN Pei-yuan
(Department of Neurology, The 456th Hospital of PLA, Jinan 250031， China)
[Abstract] AIM:To study the induction of apoptosis of pheochromocytoma (PC12) cell by L-dopa and the clinical significance. METHODS:Using PC12 cells as the model of dopaminergic neurons, in addition to electron microscopy， agarose gel electrophoresis and flow cytometry, the apoptosis ratio by L-dopa and the effect of antioxidant glutathione on PC12 cells were observed.RESULTS:Treatment of PC12 cells with L-dopa in concentrations of 50 μmol/L，100 μmol/L and 150 μmol/L respectively for 24 hours, results revealed that the apoptosis ratio was 12.8%， 24.4%， 37.2%， respectively, which is in cordant with fragment propartions of agarose gel electrophoresis, more higher than that of control(2.3%)(P<0.01).The apoptosis ratio of glutathione+L-dopa group was similar to that of control(P>0.05). CONCLUTION:Induction of apoptosis by L-dopa could be inhibited by glutathione, and oxidative damage may be involved in the pathophysiology of dopaminergic neurons death after long-term treatment of L-dopa.
, 百拇医药
[MeSH] Levodopa; Cell line; Glutathione；PC12 cells
左旋多巴(L-dopa)及其复方制剂是治疗帕金森病(Parkinsom's disease, PD)最常用且最有效缓解症状的药物，但其疗效一般在2～4年后就会逐渐减退。L-dopa治疗PD疗效减退的机制即其毒性机理不很清楚，早期大量实验已证实L-dopa对体外培养的多巴胺神经元有毒性作用[1]；后来在体动物实验发现L-dopa对预先给予6-OHDA处理的大鼠黑质多巴胺神经元有毒性作用[2]；近期发现对于预先用线粒体复合物Ⅰ抑制剂鱼藤酮处理后的中脑神经元，低剂量L-dopa 就可以造成多巴胺神经元死亡，而对其它神经元的损害作用不明显，这种损害可以被抗氧化剂所阻断[3]。虽然目前仍缺乏L-dopa在体内对黑质多巴胺神经元有毒性作用的证据[4]，但已明确氧化应激参与了PD病人多巴胺神经元变性，包括黑质神经元脂质过氧化、DNA的氧化损伤(8-羟鸟嘌呤增多)和蛋白质羰基氧化[5]。我们通过观察L-dopa对大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma，PC12)细胞的凋亡诱导作用及抗氧化剂谷胱甘肽对这一过程的影响，为进一步探讨L-dopa治疗PD疗效减退的机制提供新的思路。PC12细胞具有神经分泌细胞和神经元的性质，已广泛用于神经毒理、神经生化等方面的研究，而且PC12细胞在含有的酶类、膜受体及合成的递质等方面很接近于中脑多巴胺神经元[6]，因此我们选PC12细胞作为多巴胺神经元的细胞模型。
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材 料 和 方 法
一、实验仪器及试剂
EPICS ELITE 型流式细胞仪(美国Coulter公司)，JEM-1200型电镜(日本JEOL公司)。谷胱甘肽(glutathione, GSH)、左旋多巴、核糖核酸酶(ribonuclease, RNase)、蛋白酶K(Sigma公司)，DMEM、马血清(GIBCO公司)，其余试剂为国产分析纯。
二、细胞培养及药物处理
PC12细胞(中科院上海细胞所)置于DMEM培养液中，内含10%马血清，5%胎牛血清。于对数生长期加入L-dopa处理，使其终浓度分别为50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L，对照组加入DMEM液，另设150 μmol/L L-dopa加1.0 mmol/L GSH组。每个浓度组及对照组各8瓶，24 h后收集细胞。
, 百拇医药
三、透射电镜观察L-dopa处理的PC12细胞
细胞培养及药物处理同前，用琼脂糖预包埋法制样，常规固定，制作超薄切片，透射电镜观察、摄片。
四、DNA琼脂糖凝胶电泳
细胞培养和药物处理方法同前，24 h后收集细胞按常规方法提取DNA，走1.8%琼脂糖电泳。电泳后凝胶用计算机图像分析系统(computer documentation analysis system, CDAS)和GelBase/GeIBIot软件(UVP ImageStore 7 500, 英国)做定量分析，所得结果为DNA被RNase分解成180～200 bp的整数倍的寡聚核苷酸片段占所有DNA的百分率。
五、流式细胞术检测凋亡率
细胞培养及药物处理同前，24 h后收集细胞，PBS洗2遍，70%冷乙醇固定，PBS重悬制备单细胞悬液，加入RNase至终浓度50 μg/mL, PI(100 μg/mL)染色30 min, 流式细胞仪采集数据。
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六、统计方法
所有实验数据以均数±标准差(
±s)表示，两组间比较用两组均数的t检验。
结 果
一、透射电镜观察细胞形态学改变
单用L-dopa处理组细胞有的胞浆中溶酶体增多，线粒体增生，此时胞核固缩不明显，为早期凋亡细胞，见图1；有的胞核固缩成均质状，胞浆浓缩，胞质中出现大量空泡，溶酶体消失，剩下很多颗粒状残余物，为晚期凋亡细胞，见图2。
Fig 1 The earlier apoptosis cell, lysosomes and mitochondria increased ,chromatin condense slightly (×8 000)
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图1 早期凋亡细胞，溶酶体、线粒体增生,胞核固缩不明显
Fig 2 The later apoptosis cell, the cytoplasm concentrated and
vacuolized, chromatin condense sharply (×8 000)
图2 晚期凋亡细胞，胞浆浓缩，出现空泡,胞核固缩成均质状
二、DNA 琼脂糖电泳结果
实验结果显示对照组、L-dopa与GSH合用组未出现DNA条带，50 μmol/L组开始出现少量条带，100 μmol/L组条带增多，而150 μmol/L组则呈现典型的梯状，见图3。
, 百拇医药
Fig 3 The results from different concentrations of
L-dopa by agarose gel electrophoresis
1:control; 2:GSH+L-dopa; 3:50μmol/L L-dopa;
4:100 μmol/L L-dopa; 5.150 μmol/L L-dopa; 6:DNA mark
图3 不同浓度L-dopa处理组DNA凝胶电泳结果
三、DNA 降解的定量分析
CDAS分析DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示，对照组、L-dopa与GSH合用组、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L各浓度组细胞DNA片段化比例分别为2.5%、2.7%、13.3%、25.7%、39.8%。
, 百拇医药
四、流式细胞术检测凋亡率
凋亡细胞DNA断裂形成不同大小寡聚核苷酸片段，在FCM的DNA图上表现为G1峰前形成特征性亚二倍体峰(Ap峰)，根据该峰所占比例，可进行凋亡定量分析[7]。50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L处理组的凋亡率较对照组显著增高(P<0.01)，呈明显的量效关系；L-dopa与GSH合用组的凋亡率与对照组比较，差异无显著(P>0.05)。见表1。
表1 不同浓度L-dopa处理组的细胞凋亡百分率
Tab 1 Comparison of apoptosis ratios between different concentration L-dopa treated groups(±s，n=8) Group
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Apoptosis ratio(%)
Control
2.34±0.28
150 μmol/L+1.0 mmol/L GSH
2.57±0.04
50 μmol/L
12.46±0.43**
100 μmol/L
24.48±0.37**
150 μmol/L
, 百拇医药 37.21±1.15**
** P<0.01，vs control 讨 论
L-dopa及其复方制剂仍是目前最有效的抗PD药物，但L-dopa的疗效一般在2～4年后就逐渐减退，这种疗效减退与病程早晚无一定关系，而且常常出现运动波动、运动障碍、精神症状等副作用，其原因可能有的与药物的血浆浓度变化有关，有的与药物的代谢产物的作用以及长期用药D1、D2受体不同程度的耐受有关，而有的则可能是黑质、纹状体多巴胺合成、储存减少所致[8]。如果氧化损害介导的细胞凋亡是L-dopa损害多巴胺神经元导致疗效减退的一个原因，那么有可能通过抗氧化剂对凋亡控制系统的调节来减缓这一变性过程，就可以达到提高L-dopa疗效、改善病情的目的，所以该研究具有重要的理论意义和实用价值。
L-dopa自身氧化会产生大量自由基， Mena等指出长期应用L-dopa 能促进有害性自由基的生成增多[9]，包括超氧化物自由基、过氧化物自由基及.OH，其中.OH危害最大，自由基攻击膜的不饱和脂肪酸造成脂质过氧化分解，并促进各大分子成分(蛋白、核酸、多糖)的非酶自身氧化过程，使细胞受损、酶失活、生理功能丧失。Peter亦指出，L-dopa加速黑质神经元变性是由于L-dopa产生的自由基所致，即氧化应激参与了PD的神经元变性过程[10]。本实验结果显示50 μmol/L～150 μmol/L的L-dopa可以诱导PC12细胞凋亡，呈明显量效关系，而且GSH可以阻断L-dopa的凋亡诱导作用，提示L-dopa可能是通过氧化损害介导细胞凋亡这条途径损害多巴胺神经元，证实了最初的假设。比较流式细胞术和CDAS分析结果发现，流式细胞术测得的凋亡率和CDAS检测的片断化DNA比例基本一致，表明DNA琼脂糖电泳不仅是一种特异性的凋亡定性研究方法，还可以对凋亡作准确定量。
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[参 考 文 献]
[1]Mena MA, Pardo B, Casarejos MJ, et al. Neurotoxicity of levodopa on catecholamine-rich neurons[J]. Mov Disord, 1992, 7:23～31.
[2]Ogawa N, Asanuma M, Kawada Y, et al. Differential effects of chronic L-dopa treatment on lipid peroxidation in the mouse brain with or without pretreatment with 6-OHDA[J]. Neurosci Lett, 1994, 171: 55～58.
[3]Nakao N, Nakai K, Itakura T. Metabolic inhibition enhances selective toxicity of L-DOPA toward mesencephalic dopamine neurons in vitro[J]. Brain Res, 1997 , 777: 202～209.
, 百拇医药
[4] Fahn S. Levodopa-induced neurotoxicity: does it represent a problem for the treatment of Parkinson's disease? Cns Drugs, 1997, 8: 376～393.
[5] Alam ZI, Daniel SE, Lees AJ, et al. A generalised increase in protein carbonyls in the brain in Parkinson's but not incidental Lewy body disease. J Neurochem，1997 , 69：1326～1329.
[6]Timothy JS， William DA. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma(PC12) cells: A model for neurotoxicological studies[J]. Neurotoxicology, 1991, 12: 473～492.
, http://www.100md.com
[7]Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, et al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytomery[J]. J Immunol Methods, 1991, 139:271～273.
[8]Nutt JG, Carter JH, Woodward WR. Long-duration response to levodopa[J]. Neurology, 1995, 45:1613～1619.
[9]Mena MA, Pardo B, Casarejos MJ, et al. Neurotoxicity of levodopa on catecholamine-rich neurons[J]. Mov Disord, 1992, 7: 23～31.
[10] Peter GJ, Mitchell FB. Levodopa neurotoxicity: Experimental studies versus clinical relevance[J]. Neurology, 1998, 50(Suppl 6): S39～S46.
[收稿日期] 1999-08-05 [修回日期] 1999-10-27
, 百拇医药
单位：陈俊抛(第一军医大学珠江医院神经内科，广东 广州 510282)；王洛伟(解放军海军医学研究所，上海 200433)陈俊抛 杨玉庆 陈沛源(解放军第456医院神经内科，山东 济南 250031)
关键词：左旋多巴；细胞系；谷胱甘肽；PC l2细胞
中国病理生理杂志000522
[摘 要] 目的:研究左旋多巴(L-dopa)对大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤(PC12)细胞的凋亡诱导作用并探讨其临床意义。方法:以PC12细胞为多巴胺(DA)神经元的细胞模型，利用电镜、DNA凝胶电泳结合图象分析仪、流式细胞术(FCM)等技术检测不同浓度L-dopa所致的凋亡率以及抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)对它的影响。结果:流式术测得50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L处理组凋亡率分别为12.4%、24.4%、37.2%，与琼脂糖电泳的片断化DNA比例基本一致，与对照组(2.3%)有显著差异(P<0.01)，L-dopa与GSH合用组凋亡率2.5%与对照组比较无显著差异(P>0.05)。结论:GSH可以阻断L-dopa 对PC12细胞的凋亡诱导作用，提示L-dopa 可能是通过氧化损害介导DA神经元凋亡，导致疗效减退。
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[中图分类号] Q279 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)05-0462-04
L-dopa induction of pheochromocytoma12 cells apoptosis and the protective function of glutathione
HAN Yan, CHEN Jun-pao, WANG Luo-wei, YANG Yu-qing, CHEN Pei-yuan
(Department of Neurology, The 456th Hospital of PLA, Jinan 250031， China)
[Abstract] AIM:To study the induction of apoptosis of pheochromocytoma (PC12) cell by L-dopa and the clinical significance. METHODS:Using PC12 cells as the model of dopaminergic neurons, in addition to electron microscopy， agarose gel electrophoresis and flow cytometry, the apoptosis ratio by L-dopa and the effect of antioxidant glutathione on PC12 cells were observed.RESULTS:Treatment of PC12 cells with L-dopa in concentrations of 50 μmol/L，100 μmol/L and 150 μmol/L respectively for 24 hours, results revealed that the apoptosis ratio was 12.8%， 24.4%， 37.2%， respectively, which is in cordant with fragment propartions of agarose gel electrophoresis, more higher than that of control(2.3%)(P<0.01).The apoptosis ratio of glutathione+L-dopa group was similar to that of control(P>0.05). CONCLUTION:Induction of apoptosis by L-dopa could be inhibited by glutathione, and oxidative damage may be involved in the pathophysiology of dopaminergic neurons death after long-term treatment of L-dopa.
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[MeSH] Levodopa; Cell line; Glutathione；PC12 cells
左旋多巴(L-dopa)及其复方制剂是治疗帕金森病(Parkinsom's disease, PD)最常用且最有效缓解症状的药物，但其疗效一般在2～4年后就会逐渐减退。L-dopa治疗PD疗效减退的机制即其毒性机理不很清楚，早期大量实验已证实L-dopa对体外培养的多巴胺神经元有毒性作用[1]；后来在体动物实验发现L-dopa对预先给予6-OHDA处理的大鼠黑质多巴胺神经元有毒性作用[2]；近期发现对于预先用线粒体复合物Ⅰ抑制剂鱼藤酮处理后的中脑神经元，低剂量L-dopa 就可以造成多巴胺神经元死亡，而对其它神经元的损害作用不明显，这种损害可以被抗氧化剂所阻断[3]。虽然目前仍缺乏L-dopa在体内对黑质多巴胺神经元有毒性作用的证据[4]，但已明确氧化应激参与了PD病人多巴胺神经元变性，包括黑质神经元脂质过氧化、DNA的氧化损伤(8-羟鸟嘌呤增多)和蛋白质羰基氧化[5]。我们通过观察L-dopa对大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma，PC12)细胞的凋亡诱导作用及抗氧化剂谷胱甘肽对这一过程的影响，为进一步探讨L-dopa治疗PD疗效减退的机制提供新的思路。PC12细胞具有神经分泌细胞和神经元的性质，已广泛用于神经毒理、神经生化等方面的研究，而且PC12细胞在含有的酶类、膜受体及合成的递质等方面很接近于中脑多巴胺神经元[6]，因此我们选PC12细胞作为多巴胺神经元的细胞模型。
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材 料 和 方 法
一、实验仪器及试剂
EPICS ELITE 型流式细胞仪(美国Coulter公司)，JEM-1200型电镜(日本JEOL公司)。谷胱甘肽(glutathione, GSH)、左旋多巴、核糖核酸酶(ribonuclease, RNase)、蛋白酶K(Sigma公司)，DMEM、马血清(GIBCO公司)，其余试剂为国产分析纯。
二、细胞培养及药物处理
PC12细胞(中科院上海细胞所)置于DMEM培养液中，内含10%马血清，5%胎牛血清。于对数生长期加入L-dopa处理，使其终浓度分别为50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L，对照组加入DMEM液，另设150 μmol/L L-dopa加1.0 mmol/L GSH组。每个浓度组及对照组各8瓶，24 h后收集细胞。
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三、透射电镜观察L-dopa处理的PC12细胞
细胞培养及药物处理同前，用琼脂糖预包埋法制样，常规固定，制作超薄切片，透射电镜观察、摄片。
四、DNA琼脂糖凝胶电泳
细胞培养和药物处理方法同前，24 h后收集细胞按常规方法提取DNA，走1.8%琼脂糖电泳。电泳后凝胶用计算机图像分析系统(computer documentation analysis system, CDAS)和GelBase/GeIBIot软件(UVP ImageStore 7 500, 英国)做定量分析，所得结果为DNA被RNase分解成180～200 bp的整数倍的寡聚核苷酸片段占所有DNA的百分率。
五、流式细胞术检测凋亡率
细胞培养及药物处理同前，24 h后收集细胞，PBS洗2遍，70%冷乙醇固定，PBS重悬制备单细胞悬液，加入RNase至终浓度50 μg/mL, PI(100 μg/mL)染色30 min, 流式细胞仪采集数据。
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六、统计方法
所有实验数据以均数±标准差(
±s)表示，两组间比较用两组均数的t检验。结 果
一、透射电镜观察细胞形态学改变
单用L-dopa处理组细胞有的胞浆中溶酶体增多，线粒体增生，此时胞核固缩不明显，为早期凋亡细胞，见图1；有的胞核固缩成均质状，胞浆浓缩，胞质中出现大量空泡，溶酶体消失，剩下很多颗粒状残余物，为晚期凋亡细胞，见图2。
Fig 1 The earlier apoptosis cell, lysosomes and mitochondria increased ,chromatin condense slightly (×8 000)
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图1 早期凋亡细胞，溶酶体、线粒体增生,胞核固缩不明显
Fig 2 The later apoptosis cell, the cytoplasm concentrated and
vacuolized, chromatin condense sharply (×8 000)
图2 晚期凋亡细胞，胞浆浓缩，出现空泡,胞核固缩成均质状
二、DNA 琼脂糖电泳结果
实验结果显示对照组、L-dopa与GSH合用组未出现DNA条带，50 μmol/L组开始出现少量条带，100 μmol/L组条带增多，而150 μmol/L组则呈现典型的梯状，见图3。
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Fig 3 The results from different concentrations of
L-dopa by agarose gel electrophoresis
1:control; 2:GSH+L-dopa; 3:50μmol/L L-dopa;
4:100 μmol/L L-dopa; 5.150 μmol/L L-dopa; 6:DNA mark
图3 不同浓度L-dopa处理组DNA凝胶电泳结果
三、DNA 降解的定量分析
CDAS分析DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示，对照组、L-dopa与GSH合用组、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L各浓度组细胞DNA片段化比例分别为2.5%、2.7%、13.3%、25.7%、39.8%。
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四、流式细胞术检测凋亡率
凋亡细胞DNA断裂形成不同大小寡聚核苷酸片段，在FCM的DNA图上表现为G1峰前形成特征性亚二倍体峰(Ap峰)，根据该峰所占比例，可进行凋亡定量分析[7]。50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L处理组的凋亡率较对照组显著增高(P<0.01)，呈明显的量效关系；L-dopa与GSH合用组的凋亡率与对照组比较，差异无显著(P>0.05)。见表1。
表1 不同浓度L-dopa处理组的细胞凋亡百分率
Tab 1 Comparison of apoptosis ratios between different concentration L-dopa treated groups(
±s，n=8) Group, http://www.100md.com
Apoptosis ratio(%)
Control
2.34±0.28
150 μmol/L+1.0 mmol/L GSH
2.57±0.04
50 μmol/L
12.46±0.43**
100 μmol/L
24.48±0.37**
150 μmol/L
, 百拇医药 37.21±1.15**
** P<0.01，vs control 讨 论
L-dopa及其复方制剂仍是目前最有效的抗PD药物，但L-dopa的疗效一般在2～4年后就逐渐减退，这种疗效减退与病程早晚无一定关系，而且常常出现运动波动、运动障碍、精神症状等副作用，其原因可能有的与药物的血浆浓度变化有关，有的与药物的代谢产物的作用以及长期用药D1、D2受体不同程度的耐受有关，而有的则可能是黑质、纹状体多巴胺合成、储存减少所致[8]。如果氧化损害介导的细胞凋亡是L-dopa损害多巴胺神经元导致疗效减退的一个原因，那么有可能通过抗氧化剂对凋亡控制系统的调节来减缓这一变性过程，就可以达到提高L-dopa疗效、改善病情的目的，所以该研究具有重要的理论意义和实用价值。
L-dopa自身氧化会产生大量自由基， Mena等指出长期应用L-dopa 能促进有害性自由基的生成增多[9]，包括超氧化物自由基、过氧化物自由基及.OH，其中.OH危害最大，自由基攻击膜的不饱和脂肪酸造成脂质过氧化分解，并促进各大分子成分(蛋白、核酸、多糖)的非酶自身氧化过程，使细胞受损、酶失活、生理功能丧失。Peter亦指出，L-dopa加速黑质神经元变性是由于L-dopa产生的自由基所致，即氧化应激参与了PD的神经元变性过程[10]。本实验结果显示50 μmol/L～150 μmol/L的L-dopa可以诱导PC12细胞凋亡，呈明显量效关系，而且GSH可以阻断L-dopa的凋亡诱导作用，提示L-dopa可能是通过氧化损害介导细胞凋亡这条途径损害多巴胺神经元，证实了最初的假设。比较流式细胞术和CDAS分析结果发现，流式细胞术测得的凋亡率和CDAS检测的片断化DNA比例基本一致，表明DNA琼脂糖电泳不仅是一种特异性的凋亡定性研究方法，还可以对凋亡作准确定量。
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[参 考 文 献]
[1]Mena MA, Pardo B, Casarejos MJ, et al. Neurotoxicity of levodopa on catecholamine-rich neurons[J]. Mov Disord, 1992, 7:23～31.
[2]Ogawa N, Asanuma M, Kawada Y, et al. Differential effects of chronic L-dopa treatment on lipid peroxidation in the mouse brain with or without pretreatment with 6-OHDA[J]. Neurosci Lett, 1994, 171: 55～58.
[3]Nakao N, Nakai K, Itakura T. Metabolic inhibition enhances selective toxicity of L-DOPA toward mesencephalic dopamine neurons in vitro[J]. Brain Res, 1997 , 777: 202～209.
, 百拇医药
[4] Fahn S. Levodopa-induced neurotoxicity: does it represent a problem for the treatment of Parkinson's disease? Cns Drugs, 1997, 8: 376～393.
[5] Alam ZI, Daniel SE, Lees AJ, et al. A generalised increase in protein carbonyls in the brain in Parkinson's but not incidental Lewy body disease. J Neurochem，1997 , 69：1326～1329.
[6]Timothy JS， William DA. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma(PC12) cells: A model for neurotoxicological studies[J]. Neurotoxicology, 1991, 12: 473～492.
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[7]Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, et al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytomery[J]. J Immunol Methods, 1991, 139:271～273.
[8]Nutt JG, Carter JH, Woodward WR. Long-duration response to levodopa[J]. Neurology, 1995, 45:1613～1619.
[9]Mena MA, Pardo B, Casarejos MJ, et al. Neurotoxicity of levodopa on catecholamine-rich neurons[J]. Mov Disord, 1992, 7: 23～31.
[10] Peter GJ, Mitchell FB. Levodopa neurotoxicity: Experimental studies versus clinical relevance[J]. Neurology, 1998, 50(Suppl 6): S39～S46.
[收稿日期] 1999-08-05 [修回日期] 1999-10-27
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