残留尿苷酶对HCV cDNA破坏作用的研究
作者：杜绍财 季颖 朱凌
单位：北京医科大学第二临床肝病研究所北京肝炎试剂研制中心北京 100044
关键词：尿苷酶；聚合酶链反应；脱氧尿嘧啶核苷三磷酸
中国医师杂志001204[中图分类号] R331，Q814 [文献标识码] A [文章编号] 1008-1372(2000)12-0713-03
Study on the Effect of Residual Uracil DNA
Glycosylase upon HCV cDNA
DU Shao-cai,JI Ying,ZHU Ling
(Institute of Second Hepatology,Beijing Medical University,Beijing,10044,China)
, 百拇医药
【Abstract】 To explore the destructive effect of residual uracil DNA glycosylase on dUTP incorporation to the cDNA PCR products,PAGE and DNA-EIA hybridization technique were applied to detect the efficiency of anti-contamination and the rate of DNA hybridization.In this study,it was found that:⑴Good effect could be achieved with the reaction of 2u of uracil DNA glycosylase(UDG)for 20min at 37℃.⑵UDG could be inactivated at 94℃ for 10min.The hybridization rate of control group of PCR products was 94.18% at room temperature for 65 hours.The hybridization rates of test groups at-20℃ for 65 hours were 87.69%,77.24%，76.83%,respectively.And the inactivation times of anti-contamination groups at 94℃ were“0”min,“10”min and “20”min,respectively;at room temperature for 65 hours,these hybridization rates were 74.77%，72.50%，70.29%,respectively.There were significant differences between control and rest groups(P<0.05).However,there were no significant differences between control groups(P>0.05).Our study suggested that the hybridization rate of test groups kept at-20℃ decreased 19.41%,after 65 hours,the rate decreased 27.45%,but in control group only decreased 5.82% for 65h at room temperature.So that,we conclude that the residual UDP can cause above results.
, 百拇医药
Key Words Uracil DNA glycosylase(UDG);PCR;dUTP
自从1990年Lonog等[1]研究证实应用尿嘧啶DNA糖基化酶(尿苷酶，uracil DNA glycosylase，UDG)可消除PCR试验中的污染以来，目前已成功地用于麻风杆菌、结核杆菌、人免疫缺陷病毒、Lyme氏疏螺旋菌病[2]和HCV RNA检测技术中抗污染[3]，已获得良好的抗污染效果，Michael等[4]研究发现在抗污染试验中，残留的UDG活性对含有dUTP掺入的DNA(dU-DNA)有破坏作用。
本文对如何除去残留UDG活性进行了试验研究，现将研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
1.1.1 尿苷酶(UDG)：KPF401 100单位/支，1单位/μl GLBCOBRL产品。
1.1.2 dNTP：dUTP10-202lot B252620-24，Germany BM产品，dATP、dCTP、dGTP各100mM pharmacia产品购自华美公司。
1.1.3 全dU-DNA(含dUTP、不含dTTP)：为全dUTP PCR产物，片段长度为1.63bp。
1.1.4 标准化HCV RNA检测试剂盒：批号990808 16检体/套，分为RNA提取、PCR扩增、产物检测等3个部分，由北京医科大学第二临床学院和北京肝炎试剂研制中心生产。
1.2 方法
1.2.1 UDG抗污染方法：按0.2单位/反应、37℃ 20min，94℃ 10min灭活UDG。
, 百拇医药
1.2.2 全dU-DNA稀释方法：取全dUTP PCR产物10μl加入90μl 1×PCR反应缓冲液内、依次倍比稀释至10-1～10-8，95℃处理10min，-20℃保存备用。
1.2.3 HCV RNA检测：按试剂盒使用说明书进行。
1.2.4 HCV cDNA检测：6% PAGE和DNA-EIA方法检测。
1.2.5 DNA-EIA杂交百分率计算公式：试验组(加UDG组)A450/对照组(不加UDG组)×100%。例如：A450 1.452/A450 1.942×100%为74.77%。
1.2.6 灭活后UDG抗污染检测：取含dUTP不含dTTP的PCR反应液30μl，加入UDG。2单位37℃ 20min，在94℃ 10min灭活UDG之后，加入10-1～10-7全dUTP PCR产物3μl为模板DNA，94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 45s扩增25循环。灭活前UDG抗污染检测：取10-1～10-7全dUTP PCR产物3μl依次加入含dUTP和不含dTTP的PCR反应液内，每反应体积含0.2u UDG，37℃ 20min后，94℃灭活UDG按上述条件扩增和检测抗污染效果。
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2 结果
2.1 加热灭活对UDG抗污染效果的影响 见表1、附图。
表1 灭活前后UDG抗污染效果 HCV全dU-DNA稀释度
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
, http://www.100md.com
阴性对照
灭活前 PAGE
-
-
-
-
-
-
-
-
杂交A值
0.071
0.085
, 百拇医药 0.107
0.038
0.063
0.033
0.021
0.038
灭活后 PAGE
+
+
+
+
+
+
, 百拇医药
+
-
杂交A值
1.688
1.641
1.731
1.587
1.420
1.249
0.371
0.032
附图 UDG灭活前后抗全dU-DNA污染PAGE结果
, http://www.100md.com
1.灭活UDG后的阴性对照
2～8：灭活UDG后10-710-610-510-410-310-210-1全dU-DNA PCR PAGE结果
M：100bp-1000bp分子量标志物
9：灭活UDG前阴性对照
10～16：灭活UDG前10-710-610-510-410-310-210-1全dU-DNA模板扩增结果
2.2 加热灭活对残留UDG的破坏效果 为了观察残留UDG对PCR扩增产物的影响，试验组在PCR扩增之前PCR反应液(含0.2μ UDG、2μ Taq-p)30μl，按照本文方法进行抗污染处理后，再加入全dUDNA模板10-33μl。扩增条件如下：94℃ 30s、94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 45s，扩增30循环。该扩增产物含有残留的UDG，再次经加热灭活处理，分别放置-20℃和室温(23℃)，对照组不加UDG，以对照组A值计算杂交效率。杂交A值下降可判断残留UDG对cDNA的破坏效果，见表2。
, 百拇医药
表2 94℃灭活对残留UDG的破坏
效果A值(杂交率) 组别
有无
加VDG
有无
灭活
A
B
C
杂交A值
1
(-)
, http://www.100md.com
(-)
1.842
1.746
(89.90)
1.829
(94.18)
1.807
2
(+)
(-)
1.703
(87.69)
1.268
, 百拇医药
(65.29)
1.452
(74.77)
1.474
3
(+)
(+)
1.50
(77.24)
1.370
(70.55)
1.408
(72.50)
, http://www.100md.com
1.426
4
(+)
(+)
1.494
(76.83)
1.610
(82.90)
1.365
(70.29)
1.489
1.不加VDG的对照组，不加热；2.加VDG而不加热；3.加VDG而在94℃灭活时间10min；4.加VDG而在94℃灭活时间20min；A.-20℃保存；B.室温下(23～24℃)放置47h再加热10min，-20℃保存；C.室温放置65h，再加热20min。
, 百拇医药
表内数字为两份样吕DNA-EIA杂交A450均值。
A1、2、3、4PCR扩增完毕立即-20℃保存。B1、2、3、4室温(23℃～24℃)放置47h，94℃ 10min-20℃保存。C1、2、3、4室温放置65h，94℃ 10min，-20℃保存。阴性对照为0.01，不加UDG组与不加热组间比较差异有显著性(P<0.05)。加UDG组间比较差异无显著性(P>0.05)。
3 讨论
本文采用每反应0.2μUDG进行抗污染研究，结果显示PCR反应中加入0.2μUDG37℃ 20min抗污染处理，在94℃ 10min灭活后再加入10-1～10-7全dU-DNA模板进行扩增时，10-1～10-7电泳及DNA-EIA均为阳性。表明94℃ 10min灭活处理后，UDG不再影响cDNA的扩增。并在PCR反应液中加入10-1～10-7全dU-DNA模板，同时加入0.2μUDG进行抗污染处理灭活UDG后，直接进行扩增反应，在10-1～10-7试验中电泳及DNA-EIA杂交均为阴性。证实37℃ 20min可抗全dU-DNA 10-1～10-7污染。但是在实验中常发现在含有dUTP的PCR产物。置室温放置有降解现象，为进一步证实是否残留UDG对dU-DNA有破坏作用。本文对抗污染和不抗污染的PCR产物进行了分析研究。
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本文以不加UDG组-20℃保存65h的PCR产物DNA-EIA杂交A值为标准计算UDG组杂交百分率。结果显示不加UDG组-20℃ 65h杂交A值为1.842，室温65h A值为1.829，而UDG抗污染“0min”组-20℃ 65hA值为1.703(87.69%)，室温(23℃～24℃)65h A值为1.452(74.77%)，“10min”组-20℃ 65h A值为1.500(77.24%)，室温65h A值为1.408(72.50%)，“20min”组A值为1.4923(76.83%)和1.365(70.29%)。3组无明显区别，但-20℃保存样品的杂交百分率(87.69%、77.24%、76.83%，均值80.59%)均高于室温保存65h样品(74.77%、72.50%、70.29%，均值72.52%)前者比后者A值高8.07，18份样品每小时(60min)A值下降0.124。以上结果表明：⑴这种造成杂交百分率降低的原因可能与残留UDG有关(P<0.05)。⑵产物经94℃灭活10min和20min不能提高杂交率，表明加热灭活可灭活UDG的活性，但不能清除残留UDG活性(组内比较P>0.05)。⑶-20℃低温保存PCR样品可抑制部分残留UDG对dU-DNA的破坏作用。⑷对照-20℃保存65h A450为1.942，室温65h，A450值为1.829，下降5.82%，本组未加入UDG，不存在残留UDG问题，提示在PCR反应液内还存有其它破坏因素，是否为使用的酶制品中具有微量的核酸外切酶活性，有待进一步研究证实。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Long MC,Berninger MS,Hartley JL.Use of uracil DNA glycosylase to control carry over contamination in polymerase chain reactions.Gene 1990；93：125～128
2，黄培堂，余炜源，陈添弥，等译.PCR技术实验指南.北京：科学出版社出版 1998；8：15
3，杜绍财，陶其敏，朱凌，等.RT PCR抗污染研究.中华肝脏病杂志 1996；4(1)：41
4，Michael R,perschil L,Altwegg M.Influence of residual uracil-DNA glycosylase acitvity on the electrophoretic migration of dUTP-containing PCR products.Journal of Microbiological Methods 1999；35：73
[收稿日期：2000-08-23], http://www.100md.com
单位：北京医科大学第二临床肝病研究所北京肝炎试剂研制中心北京 100044
关键词：尿苷酶；聚合酶链反应；脱氧尿嘧啶核苷三磷酸
中国医师杂志001204[中图分类号] R331，Q814 [文献标识码] A [文章编号] 1008-1372(2000)12-0713-03
Study on the Effect of Residual Uracil DNA
Glycosylase upon HCV cDNA
DU Shao-cai,JI Ying,ZHU Ling
(Institute of Second Hepatology,Beijing Medical University,Beijing,10044,China)
, 百拇医药
【Abstract】 To explore the destructive effect of residual uracil DNA glycosylase on dUTP incorporation to the cDNA PCR products,PAGE and DNA-EIA hybridization technique were applied to detect the efficiency of anti-contamination and the rate of DNA hybridization.In this study,it was found that:⑴Good effect could be achieved with the reaction of 2u of uracil DNA glycosylase(UDG)for 20min at 37℃.⑵UDG could be inactivated at 94℃ for 10min.The hybridization rate of control group of PCR products was 94.18% at room temperature for 65 hours.The hybridization rates of test groups at-20℃ for 65 hours were 87.69%,77.24%，76.83%,respectively.And the inactivation times of anti-contamination groups at 94℃ were“0”min,“10”min and “20”min,respectively;at room temperature for 65 hours,these hybridization rates were 74.77%，72.50%，70.29%,respectively.There were significant differences between control and rest groups(P<0.05).However,there were no significant differences between control groups(P>0.05).Our study suggested that the hybridization rate of test groups kept at-20℃ decreased 19.41%,after 65 hours,the rate decreased 27.45%,but in control group only decreased 5.82% for 65h at room temperature.So that,we conclude that the residual UDP can cause above results.
, 百拇医药
Key Words Uracil DNA glycosylase(UDG);PCR;dUTP
自从1990年Lonog等[1]研究证实应用尿嘧啶DNA糖基化酶(尿苷酶，uracil DNA glycosylase，UDG)可消除PCR试验中的污染以来，目前已成功地用于麻风杆菌、结核杆菌、人免疫缺陷病毒、Lyme氏疏螺旋菌病[2]和HCV RNA检测技术中抗污染[3]，已获得良好的抗污染效果，Michael等[4]研究发现在抗污染试验中，残留的UDG活性对含有dUTP掺入的DNA(dU-DNA)有破坏作用。
本文对如何除去残留UDG活性进行了试验研究，现将研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
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1.1.1 尿苷酶(UDG)：KPF401 100单位/支，1单位/μl GLBCOBRL产品。
1.1.2 dNTP：dUTP10-202lot B252620-24，Germany BM产品，dATP、dCTP、dGTP各100mM pharmacia产品购自华美公司。
1.1.3 全dU-DNA(含dUTP、不含dTTP)：为全dUTP PCR产物，片段长度为1.63bp。
1.1.4 标准化HCV RNA检测试剂盒：批号990808 16检体/套，分为RNA提取、PCR扩增、产物检测等3个部分，由北京医科大学第二临床学院和北京肝炎试剂研制中心生产。
1.2 方法
1.2.1 UDG抗污染方法：按0.2单位/反应、37℃ 20min，94℃ 10min灭活UDG。
, 百拇医药
1.2.2 全dU-DNA稀释方法：取全dUTP PCR产物10μl加入90μl 1×PCR反应缓冲液内、依次倍比稀释至10-1～10-8，95℃处理10min，-20℃保存备用。
1.2.3 HCV RNA检测：按试剂盒使用说明书进行。
1.2.4 HCV cDNA检测：6% PAGE和DNA-EIA方法检测。
1.2.5 DNA-EIA杂交百分率计算公式：试验组(加UDG组)A450/对照组(不加UDG组)×100%。例如：A450 1.452/A450 1.942×100%为74.77%。
1.2.6 灭活后UDG抗污染检测：取含dUTP不含dTTP的PCR反应液30μl，加入UDG。2单位37℃ 20min，在94℃ 10min灭活UDG之后，加入10-1～10-7全dUTP PCR产物3μl为模板DNA，94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 45s扩增25循环。灭活前UDG抗污染检测：取10-1～10-7全dUTP PCR产物3μl依次加入含dUTP和不含dTTP的PCR反应液内，每反应体积含0.2u UDG，37℃ 20min后，94℃灭活UDG按上述条件扩增和检测抗污染效果。
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2 结果
2.1 加热灭活对UDG抗污染效果的影响 见表1、附图。
表1 灭活前后UDG抗污染效果 HCV全dU-DNA稀释度
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
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阴性对照
灭活前 PAGE
-
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杂交A值
0.071
0.085
, 百拇医药 0.107
0.038
0.063
0.033
0.021
0.038
灭活后 PAGE
+
+
+
+
+
+
, 百拇医药
+
-
杂交A值
1.688
1.641
1.731
1.587
1.420
1.249
0.371
0.032
附图 UDG灭活前后抗全dU-DNA污染PAGE结果
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1.灭活UDG后的阴性对照
2～8：灭活UDG后10-710-610-510-410-310-210-1全dU-DNA PCR PAGE结果
M：100bp-1000bp分子量标志物
9：灭活UDG前阴性对照
10～16：灭活UDG前10-710-610-510-410-310-210-1全dU-DNA模板扩增结果
2.2 加热灭活对残留UDG的破坏效果 为了观察残留UDG对PCR扩增产物的影响，试验组在PCR扩增之前PCR反应液(含0.2μ UDG、2μ Taq-p)30μl，按照本文方法进行抗污染处理后，再加入全dUDNA模板10-33μl。扩增条件如下：94℃ 30s、94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 45s，扩增30循环。该扩增产物含有残留的UDG，再次经加热灭活处理，分别放置-20℃和室温(23℃)，对照组不加UDG，以对照组A值计算杂交效率。杂交A值下降可判断残留UDG对cDNA的破坏效果，见表2。
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表2 94℃灭活对残留UDG的破坏
效果A值(杂交率) 组别
有无
加VDG
有无
灭活
A
B
C
杂交A值
1
(-)
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(-)
1.842
1.746
(89.90)
1.829
(94.18)
1.807
2
(+)
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1.703
(87.69)
1.268
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(65.29)
1.452
(74.77)
1.474
3
(+)
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1.50
(77.24)
1.370
(70.55)
1.408
(72.50)
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1.426
4
(+)
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1.494
(76.83)
1.610
(82.90)
1.365
(70.29)
1.489
1.不加VDG的对照组，不加热；2.加VDG而不加热；3.加VDG而在94℃灭活时间10min；4.加VDG而在94℃灭活时间20min；A.-20℃保存；B.室温下(23～24℃)放置47h再加热10min，-20℃保存；C.室温放置65h，再加热20min。
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表内数字为两份样吕DNA-EIA杂交A450均值。
A1、2、3、4PCR扩增完毕立即-20℃保存。B1、2、3、4室温(23℃～24℃)放置47h，94℃ 10min-20℃保存。C1、2、3、4室温放置65h，94℃ 10min，-20℃保存。阴性对照为0.01，不加UDG组与不加热组间比较差异有显著性(P<0.05)。加UDG组间比较差异无显著性(P>0.05)。
3 讨论
本文采用每反应0.2μUDG进行抗污染研究，结果显示PCR反应中加入0.2μUDG37℃ 20min抗污染处理，在94℃ 10min灭活后再加入10-1～10-7全dU-DNA模板进行扩增时，10-1～10-7电泳及DNA-EIA均为阳性。表明94℃ 10min灭活处理后，UDG不再影响cDNA的扩增。并在PCR反应液中加入10-1～10-7全dU-DNA模板，同时加入0.2μUDG进行抗污染处理灭活UDG后，直接进行扩增反应，在10-1～10-7试验中电泳及DNA-EIA杂交均为阴性。证实37℃ 20min可抗全dU-DNA 10-1～10-7污染。但是在实验中常发现在含有dUTP的PCR产物。置室温放置有降解现象，为进一步证实是否残留UDG对dU-DNA有破坏作用。本文对抗污染和不抗污染的PCR产物进行了分析研究。
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本文以不加UDG组-20℃保存65h的PCR产物DNA-EIA杂交A值为标准计算UDG组杂交百分率。结果显示不加UDG组-20℃ 65h杂交A值为1.842，室温65h A值为1.829，而UDG抗污染“0min”组-20℃ 65hA值为1.703(87.69%)，室温(23℃～24℃)65h A值为1.452(74.77%)，“10min”组-20℃ 65h A值为1.500(77.24%)，室温65h A值为1.408(72.50%)，“20min”组A值为1.4923(76.83%)和1.365(70.29%)。3组无明显区别，但-20℃保存样品的杂交百分率(87.69%、77.24%、76.83%，均值80.59%)均高于室温保存65h样品(74.77%、72.50%、70.29%，均值72.52%)前者比后者A值高8.07，18份样品每小时(60min)A值下降0.124。以上结果表明：⑴这种造成杂交百分率降低的原因可能与残留UDG有关(P<0.05)。⑵产物经94℃灭活10min和20min不能提高杂交率，表明加热灭活可灭活UDG的活性，但不能清除残留UDG活性(组内比较P>0.05)。⑶-20℃低温保存PCR样品可抑制部分残留UDG对dU-DNA的破坏作用。⑷对照-20℃保存65h A450为1.942，室温65h，A450值为1.829，下降5.82%，本组未加入UDG，不存在残留UDG问题，提示在PCR反应液内还存有其它破坏因素，是否为使用的酶制品中具有微量的核酸外切酶活性，有待进一步研究证实。
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参考文献
1，Long MC,Berninger MS,Hartley JL.Use of uracil DNA glycosylase to control carry over contamination in polymerase chain reactions.Gene 1990；93：125～128
2，黄培堂，余炜源，陈添弥，等译.PCR技术实验指南.北京：科学出版社出版 1998；8：15
3，杜绍财，陶其敏，朱凌，等.RT PCR抗污染研究.中华肝脏病杂志 1996；4(1)：41
4，Michael R,perschil L,Altwegg M.Influence of residual uracil-DNA glycosylase acitvity on the electrophoretic migration of dUTP-containing PCR products.Journal of Microbiological Methods 1999；35：73
[收稿日期：2000-08-23], http://www.100md.com