鼻咽癌抗独特型抗体诱导的体液和细胞免疫应答
作者：李官成 朱建高 周国华 孙去病
单位：官成(湖南医科大学肿瘤研究 所，湖南长沙410078)；朱建高(湖南医科大学肿瘤研究 所，湖南长沙410078)；周国华(湖南医科大学肿瘤研究 所，湖南长沙410078)；孙去病(湖南医科大学肿瘤研究 所，湖南长沙410078)
关键词：抗独特型抗体；抗抗独特型抗体；迟发型超敏反应；；细胞增殖
细胞与分子免疫学杂志000214
摘要：目的 探讨抗独特型抗体(Ab2)2H4和5D3模拟抗原诱导免疫应答的能力。方法 用Ab2免疫Balb/c小鼠获得抗血清，以ELISA检测其Ab3，WesternBlot分析其识别抗原的分子质量。用迟发型
超敏反应(DTH)和淋巴细胞增殖试验，检测Ab2诱发细胞免疫反应的能力。结果 2H4,5D3免疫同系动物产生的含有抗抗独特型抗体(Ab3)的抗血清，可特异性地与靶细胞结合。FC2(Ab1)和经2H4免
, 百拇医药
疫的Ab3可识别相对分子质量(Mr)相同约68000的抗原，且不同于HNL5(Ab1)和5D3免疫的Ab3所识别的抗原(Mr80000)。在DTH试验中，所致小鼠足垫肿大的程度，2H4和5D3实验组均显著高于对照组。而在淋巴细胞增殖试验中，Ab2免疫鼠脾T细胞在体外对靶细胞或Ab2的再次刺激呈现明显的细胞增殖反应，而无关肿瘤细胞或抗体的刺激则不能引起细胞增殖。结论 抗独特型抗体2H4和5D3具有鼻咽癌相关抗原的内影像，能模拟不同分子质量的鼻咽癌相关抗原诱导体液和细胞免疫应答。
中图号：R739.6 文献标识码：A
文章编号：1007-8738(2000)02-0134-04
Induction of humoral and cellular immune responses with anti- idiotypic antibody for nasopharyngeal carcinoma
, 百拇医药
LI Guan- cheng ZHU Jian- gao ZHOU Guo- hua SUN Qu- bing
(Cancer Research Institute, Hunan Medical University, Changsha 410078, Hunan Province, China)
Abstract: Aim To Study the efficacy of monoclonal anti- idiotype antibodies (Ab2)2H4 and 5D3 to induce humoral and cellular immune responses. Methods 2H4 and 5D3 were used to immunize mice. Ab3 in anti- sera were tested by ELISA and Western blot. Cell- mediated immunity to tumors induced by Ab2 was investigated by a delayed- type hypersensitivity(DTH)response and mouse T- cell proliferation assay. Results The anti- sera derived from the immunized mice containing anti- anti- idiotype antibodies(Ab3) bound specifically to NPC cell line (HNE2). Using Western blot and immunostaining, Ab1(FC2 or HNL5) and Ab3 sera derived from mice immunized with Ab2 (2H4 or 5D3)recognized the antigenic determinants with the relative molecular mass(Mr)of 68 000 and 80 000, respectively. Mice immunized with 2H4 or 5D3 coupled with KLH occurred positive and specific DTH reaction after NPC cell stimulation. The results of mice T cells proliferation assay indicated that proliferarive response of the splenocytes in experimental groups was significantly higher than that in control groups.Conclusion Bearing the internal image of NPC associated antigen,anti- idiotype antibodies(Ab2)2H4 and 5D3 imitated antigen that vary in the relarive molecular mass.They could induce humoral and cellular immune responses in syngenetic mice and might substitute for NPC associated antigen as a good NPC candidate vaccine.
, http://www.100md.com
Keywords: ani- idiotypic antibody; anti- anti- idiotypic antibody; delayed- type hypersensitivity; cells proliferation
机体的免疫状态与肿瘤发生、发展有着密切的关系。一般认为，机体在发生肿瘤时，其免疫系统由于肿瘤本身或其诱导的抑制作用而处于功能低下状态，包括体液免疫和细胞免疫抑制〔1〕。Hanna等〔2〕根据荷瘤小鼠脾赃中的巨噬细胞可抑制正常免疫活性细胞的免疫反应；而荷瘤小鼠脾淋巴细胞对有丝分裂原(PHA和LPS)的反应能力亦减低，但只是免疫功能受到抑制。因此，通过某些途径如用模拟抗原Ab2β进行主动免疫等，有可能激活机体被抑制的细胞免疫和体液免疫功能，由此发挥积极的抗肿瘤免疫效应，这已引起人们的关注。我们以杂交瘤技术制备了两株模仿人鼻咽癌(NPC)相关抗原的单克隆抗独特型抗体(Ab2)2H4和5D3。本实验将继续研究其在动物实验中诱导产生抗肿瘤的细胞免疫和体液免疫的能力，以为筛选可用于 临床的抗独特型疫苗提供依据。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 单克隆抗独特型抗体(Ab2)以B淋巴细胞杂交瘤技术，制备了两株抗鼻咽癌单克隆抗体FC2和HNL5(Ab1)独特型的抗独特型抗体(Ab2)2H4和5D3。常规制备2H4，5D3腹水，依次经硫酸铵盐析沉淀和SephacrylS-300HR柱层析纯化后，以SDS-PAGE分析其纯度。抗体与KLH交联物的制备：取1g/L纯化的2H4，5D3和正常小鼠IgG(mIgG)2mL，分别与2mL质量浓度为1g/L的钥孔血蓝素(KLH)溶液混合；立即加入250mL/L戊二醛溶液40μL，室温振荡2h，即获得2H4-KLH，5D3-KLH和mIgG-KLH交联物。
1.2 方法
1.2.1 Ab2诱导的体液免疫应答 取100μg2H4-KLH或5D3-KLH交联物，与CFA，IFA和PBS混合物，于0，14和28d，ip免疫Balb/c小鼠，眶静脉采血，分离血清。①Ab2与靶细胞HNE2的反应性：以5×104HNE2鼻咽癌细胞/孔铺板，加1.5mL/L戊二醛溶液固定、封板。依次加入对倍系列稀释的Ab2免疫血清(Ab3)(每孔100μL，37℃2h，PBS-Tween20洗板)，HRP-兔抗鼠IgG+A+M(ZymedLab)(37℃2h，洗板)和底物ABTS(显色20min)，用ELX800型酶标仪(Bio-Tek)测定A405nm。②Ab2与酶标记Ab1对靶抗原的竞争性：用对倍系列稀释的Ab2免疫血清(Ab3)加入96孔HNE2细胞板(每孔50μL)，同时加等量酶标记的Ab1，37℃2h，洗板，加底物ABTS显色20min，测定A405nm。③HNE2细胞粗抗原的Westernblot分析〔3〕：用溶解缓冲液提取HNE2细胞粗抗原，再用75g/L分离胶和50g/L浓缩胶的不连续解离缓冲系统进行SDS-PAGE，稳流50mA，于15℃电泳约2.5h。电泳后，制成由转移缓冲液浸湿的滤纸、硝酸纤维膜(nitrocellulose membrane,NC膜)和凝胶组成的转移单位，于15℃在0.8mA/cm2的条件下，进行半干湿法电泳转移约1h。将转移后的NC膜用Ab1和Ab3免疫染色，根据相对迁移率分别计算Ab1和Ab3所识别的抗原的Mr。
, 百拇医药
1.2.2 Ab2诱导的细胞免疫应答 ①迟发型超敏反应(DTH)〔4〕:将8～10wk龄Balb/c小鼠随机分成实验一组、二组和对照组。实验组分别在0，14和28d，用100μg2H4-KLH交联物(一组)或5D3-KLH交联物(二组)与等体积CFA，IFA和PBS的混合物ip。50d后，用200Gy60Coγ射线照射过的人鼻咽癌细胞HNE2和人B淋巴细胞分别注射于小鼠的右、左后足垫，细胞数为5×105，体积为20μL，对照组小鼠除用mIgG-KLH免疫外，其余完全同实验组。在注射前及注射后24，48和72h，分别用0.02mm千分尺测量足垫厚度。将右后足垫的厚度减去其注射前的厚度与左后足垫的厚度减去其注
射前厚度的差值即为肿大的程度。结果以平均值±标准差表示，用完全随机设计的两样本均数比较的t检验做统计学分析。②脾细胞增殖试验〔5〕：将2H4-KLH和5D3-KLH交联物分别与CFA混合，充分乳化后，分别通过腹腔注射免疫Balb/c小鼠。于第14天，用相同免疫原的IFA混合物加强注射，两周后拉颈处死小鼠，无菌取脾脏制成单个细胞悬液，用含100mL/L小牛血清的DMEM调整细胞浓度至5×108/L，分配于96孔细胞板，每孔100μL。每4孔作为一组平行孔，每孔加入100μL含104预先用60C0γ射线200Gy照射过的人鼻咽癌相关抗原阳性细胞(HNE2)，或大肠癌细胞株HRT-18，或100μL含200ng的无菌纯化抗独特型抗体(2H4/5D3)，或无关抗体(抗人大肠癌的鼠mAbHb3)；空白对照加100μLDMEM。将细胞置50mL/LCO2孵箱培养5d后，每孔加入37kBq[3H]-TdR培养24h，收集细胞于玻璃纤维纸上，自然干燥后，置滤纸于盛有闪烁液的测量杯内，用液闪计数器计数cpm值。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 Ab2的纯化与检测 2H4，5D3腹水经硫酸铵盐析再过Sephacryl S-300HR柱层析，获得高纯度、高抗体活性的纯化Ab2。①ELISA检测：将以Ab2免疫小鼠获得的抗血清(Ab3)对倍系列稀释后，用ELISA检测其与靶细胞HNE2的反应性。结果显示，Ab22H4或5D3免疫小鼠产生的Ab3可特异性地与HNE2细胞结合(图1)。用竞争抑制试验检测Ab3与相应Ab1(FC2/HNL5)竞争鼻咽癌细胞上抗原的结果显示，当采用一定量的酶标记Ab1(12mg/L)时，随着相对应的Ab3血清浓度的下降，A405nm值则随之上升，呈剂量依赖关系(图2)。这表明多克隆Ab3可与Ab1结合相同的抗原，具有相同的独特位，从而间接证明Ab2(2H4/5D3)属于β型抗独特型抗体。②Westernblot分析：将从HNE2细胞提取的粗抗原经SDS-PAGE后进行免疫印迹，NC膜用丽春红-S染色发现，粗抗原溶液显示数条区带，用Ab3和Ab1进行免疫酶检测，发现FC2(Ab1)与2H4免疫血清(Ab3)识别的抗原相同，Mr约68000；HNL-5(Ab1)与用5D3免疫的血清(Ab3)亦可作用于相同的抗原决定簇(Mr约80000)(图3)。
, 百拇医药
图1 Ab3与HNE2细胞结合反应的检测
Fig1 The detection of Ab3 binding to HNE2 cells
图2 Ab3与Ab1竞争HNE2细胞上抗原的竞争抑制试验
Fig2 The competitive inhibition test of Ab3-containing sera
with Ab1 for tumor associated antigen on HNE2 cells
图3 HNE2细胞提取的粗抗原的免疫印迹分析
, 百拇医药
Fig3 Western blot analysis of crude antigen extracted from HNE2 cells
A:Standard molecular protein(Mr);B:mAb FC2;C:Ab3 sera primed
with 2H4;D:mAb HNL 5;E:Ab3 sera primed with 5D3.
2.2 Ab2诱导细胞介导的免疫应答 ①DTH：以人肿瘤细胞作为刺激细胞攻击经Ab2免疫的Balb/c小鼠，观察局部的DTH。计算公式：以注射肿瘤细胞(HNE2)的小鼠右后足垫厚度与注射前厚度的差值减去注射人B淋巴细胞的小鼠左后足垫厚度与注射前的差值，即为肿大程度的数值。实验1组(2H4免疫，n=10):48h的肿大为(65±15)×10-2mm；实验2组(5D3免疫，n=10):48h的肿大为(55±19)×10-2mm，对照组(mIgG免疫，n=9)；48h的肿大为(7±4)×10-2mm。实验1组与对照组相比较，有极显著的差异(t1=11.3114,P1<0.001)；实验2组与对照组相比较，亦有极显著的差异(t2=7.5815,P1<0.002)，说明2H4/5D3能特异性地诱导对鼻咽癌细胞的DTH反应，并可持续72h(图4)。②T细胞增殖试验用2H4-KLH,5D3-KLH和mIgG-KLH交联物免疫小鼠，再在体外用靶细胞(HNE2)和无关肿瘤细胞(HRT-18)刺激免疫脾T细胞。结果发现，经靶细胞刺激后，Ab2免疫的脾T细胞的增殖反应显著高于mIgG免疫的脾T细胞(t1=27.5548,P1<0.001;t2=7.7784，P1<0.001)；而对无关肿瘤细胞的刺激无差异(t1=0.3620,P1>0.5;t2=1.3595,P2>0.2)。同样，Ab2免疫的脾T细胞经Ab2再次刺激后，其增殖反应亦显著高于mIgG免疫的脾T细胞；而对无关抗体(Hb3)的刺激，各组免疫脾细胞的增殖反应无差异(表1)。说明免疫脾细胞对特异抗原的刺激具有明显的增 殖反应，而对非相关抗原的刺激则不出现细胞增殖。
, http://www.100md.com
图4 Ab2诱导的迟发型超敏反应
Fig4 DTH induced by Ab2
表1 3组小鼠脾细胞的增殖试验
Tab1 Proliferative test of splenocytes from 3 group mice Stimulator
cpm value
2H4-immunized
group(1)
5D3-immunized
group(2)
mouse IgG-immunized
, http://www.100md.com
group(3)
Blank group
133±15a
140±8a
149±8
HNE2(104)
1226±56b
1229±99b
275±41
HRT-18(104)
, http://www.100md.com
316±18a
340±30a
309±34
2H4(10mg/L)
1286±78b
815±17b
430±31
5D3(10mg/L)
896±46b
1309±107b
, 百拇医药
449±41
Hb3(10mg/L)
330±51a
316±39a
382±37
aP>0.05,bP<0.001vs(1)or(2).
3 讨论
抗独特型抗体作为分子模拟物已广泛应用于新一代疫苗的研制〔6〕，并用作生物受体的探针〔7〕、肿瘤的免疫治疗〔8，9〕等。我们的目的是，证实Ab22H4和5D3能否成为肿瘤的治疗制剂或为肿瘤疫苗提供依据。由于2H4和5D3为抗原的内影像，故必然能够模拟抗原诱导机体产生特异性的抗体应答，即产生Ab3。以2H4和5D3免疫同系动物诱导产生的Ab3，能与鼻咽癌细胞上的相应抗原结合。Westernblot分析显示，FC2(Ab1)和2H4免疫的Ab3均能识别Mr68000的抗原，且不同于HNL5(Ab1)和5D3免疫的Ab2所识别的抗原(Mr80000)，提示2H4和5D3均能诱导体液免疫应答，但模拟的鼻咽癌相关抗原不同。
, 百拇医药
同样，抗独特型抗体也应能够诱导细胞介导的免疫应答，通过检测局部的DTH和T细胞增殖反应试验可以证实。我们用Ab2免疫小鼠后再用鼻咽癌细胞进行攻击，注射局部出现DTH，反应可持续72h，以48h最为明显。另外，用免疫脾细胞在体外用抗原特异性肿瘤细胞或模拟抗原Ab2刺激后，出现显著的细胞增殖。以上结果说明，2H4和5D3均可模拟鼻咽癌相关抗原，使免疫小鼠产生对鼻咽癌相关抗原的特异性细胞免疫应答。
基金项目：国家自然科学基金资助,No.39270706
作者简介：李官成，男，39岁，副教授，医学博士长沙市开福区湘雅路88号,Tel.(0731)4805445 2000byJCellMolImmunolPresswww.immunology.net/jcmi;Email.immuedit@fmmu.edu.cn
参考文献：
, 百拇医药
〔1〕 Moudgil KD,Sercarz EE. Can antitumor immune responses discriminate between self and nonself〔J〕Immunol Today, 1994;15:353- 355.
〔2〕 Hanna N, Kripke ML. Immunologic significance of nonspecific suppressor cells in spleens of tumor- bearing mice〔 J〕 . Cell Immunol, 1979;43(2):293- 303.
〔 3〕 李官成，孙去病.肿瘤相关抗原CA Hb3对大肠癌血清学诊断的价值〔J〕. 中国肿瘤临床 ， 1996； 23(3):173- 177.
〔4〕 Chen ZJ, Yang H, Ferrone S. Human high moleular weight mela- noma- associated antigen mimicry by mouse anti- idiotypic monoclonal antibody MK2-23〔J〕 . J Immunol, 1991;147:1082- 1090.
, 百拇医药
〔5〕 Durrant LG, Denton GWL, Jacobs E, et al. An idiotypic replicon of carcinoembryonic antigen inducing cellular and humoral responses directed against human colorectal tumor〔J〕 . Int J Cancer, 1992;50:811- 816.
〔6〕 Su S, Ward MM, Apicella MA, et al. A nontoxic, idiotope vaccine against Gram- negative bacterial infections〔J〕 . J Immunol, 1992;148:234- 238.
〔7〕 Jennings IL, Kemp BE, Cotton RGH. Localization of cofactor binding sites with monoclonal anti- idiotype antibodies: phenylalanine hydroxylase〔 J〕 . Proc Natl Acad Sci USA, 1991;88:5734- 5738.
, 百拇医药
〔8〕 Schultes BC, Baum RP, Niesen A, et al. Anti- idiotype induction therapy: anti- CA125 antibodies (Ab3)mediated tumor killing in patients treated with ovarex mAb B43.13(Ab1)〔 J〕 . Cancer Immunol Immunother,1998;46:201- 212.
〔9〕 Foon KA, Sen G, Hutchins L, et al. Antibody responses in melanoma patients immunized with an anti- idiotype antibody mimicking disialoganglioside GD2〔J〕 . Clin Cancer Res,1998;4:1117- 1124.
收稿日期：1999-07-19
修回日期：1999-10-14, http://www.100md.com
单位：官成(湖南医科大学肿瘤研究 所，湖南长沙410078)；朱建高(湖南医科大学肿瘤研究 所，湖南长沙410078)；周国华(湖南医科大学肿瘤研究 所，湖南长沙410078)；孙去病(湖南医科大学肿瘤研究 所，湖南长沙410078)
关键词：抗独特型抗体；抗抗独特型抗体；迟发型超敏反应；；细胞增殖
细胞与分子免疫学杂志000214
摘要：目的 探讨抗独特型抗体(Ab2)2H4和5D3模拟抗原诱导免疫应答的能力。方法 用Ab2免疫Balb/c小鼠获得抗血清，以ELISA检测其Ab3，WesternBlot分析其识别抗原的分子质量。用迟发型
超敏反应(DTH)和淋巴细胞增殖试验，检测Ab2诱发细胞免疫反应的能力。结果 2H4,5D3免疫同系动物产生的含有抗抗独特型抗体(Ab3)的抗血清，可特异性地与靶细胞结合。FC2(Ab1)和经2H4免
, 百拇医药
疫的Ab3可识别相对分子质量(Mr)相同约68000的抗原，且不同于HNL5(Ab1)和5D3免疫的Ab3所识别的抗原(Mr80000)。在DTH试验中，所致小鼠足垫肿大的程度，2H4和5D3实验组均显著高于对照组。而在淋巴细胞增殖试验中，Ab2免疫鼠脾T细胞在体外对靶细胞或Ab2的再次刺激呈现明显的细胞增殖反应，而无关肿瘤细胞或抗体的刺激则不能引起细胞增殖。结论 抗独特型抗体2H4和5D3具有鼻咽癌相关抗原的内影像，能模拟不同分子质量的鼻咽癌相关抗原诱导体液和细胞免疫应答。
中图号：R739.6 文献标识码：A
文章编号：1007-8738(2000)02-0134-04
Induction of humoral and cellular immune responses with anti- idiotypic antibody for nasopharyngeal carcinoma
, 百拇医药
LI Guan- cheng ZHU Jian- gao ZHOU Guo- hua SUN Qu- bing
(Cancer Research Institute, Hunan Medical University, Changsha 410078, Hunan Province, China)
Abstract: Aim To Study the efficacy of monoclonal anti- idiotype antibodies (Ab2)2H4 and 5D3 to induce humoral and cellular immune responses. Methods 2H4 and 5D3 were used to immunize mice. Ab3 in anti- sera were tested by ELISA and Western blot. Cell- mediated immunity to tumors induced by Ab2 was investigated by a delayed- type hypersensitivity(DTH)response and mouse T- cell proliferation assay. Results The anti- sera derived from the immunized mice containing anti- anti- idiotype antibodies(Ab3) bound specifically to NPC cell line (HNE2). Using Western blot and immunostaining, Ab1(FC2 or HNL5) and Ab3 sera derived from mice immunized with Ab2 (2H4 or 5D3)recognized the antigenic determinants with the relative molecular mass(Mr)of 68 000 and 80 000, respectively. Mice immunized with 2H4 or 5D3 coupled with KLH occurred positive and specific DTH reaction after NPC cell stimulation. The results of mice T cells proliferation assay indicated that proliferarive response of the splenocytes in experimental groups was significantly higher than that in control groups.Conclusion Bearing the internal image of NPC associated antigen,anti- idiotype antibodies(Ab2)2H4 and 5D3 imitated antigen that vary in the relarive molecular mass.They could induce humoral and cellular immune responses in syngenetic mice and might substitute for NPC associated antigen as a good NPC candidate vaccine.
, http://www.100md.com
Keywords: ani- idiotypic antibody; anti- anti- idiotypic antibody; delayed- type hypersensitivity; cells proliferation
机体的免疫状态与肿瘤发生、发展有着密切的关系。一般认为，机体在发生肿瘤时，其免疫系统由于肿瘤本身或其诱导的抑制作用而处于功能低下状态，包括体液免疫和细胞免疫抑制〔1〕。Hanna等〔2〕根据荷瘤小鼠脾赃中的巨噬细胞可抑制正常免疫活性细胞的免疫反应；而荷瘤小鼠脾淋巴细胞对有丝分裂原(PHA和LPS)的反应能力亦减低，但只是免疫功能受到抑制。因此，通过某些途径如用模拟抗原Ab2β进行主动免疫等，有可能激活机体被抑制的细胞免疫和体液免疫功能，由此发挥积极的抗肿瘤免疫效应，这已引起人们的关注。我们以杂交瘤技术制备了两株模仿人鼻咽癌(NPC)相关抗原的单克隆抗独特型抗体(Ab2)2H4和5D3。本实验将继续研究其在动物实验中诱导产生抗肿瘤的细胞免疫和体液免疫的能力，以为筛选可用于 临床的抗独特型疫苗提供依据。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 单克隆抗独特型抗体(Ab2)以B淋巴细胞杂交瘤技术，制备了两株抗鼻咽癌单克隆抗体FC2和HNL5(Ab1)独特型的抗独特型抗体(Ab2)2H4和5D3。常规制备2H4，5D3腹水，依次经硫酸铵盐析沉淀和SephacrylS-300HR柱层析纯化后，以SDS-PAGE分析其纯度。抗体与KLH交联物的制备：取1g/L纯化的2H4，5D3和正常小鼠IgG(mIgG)2mL，分别与2mL质量浓度为1g/L的钥孔血蓝素(KLH)溶液混合；立即加入250mL/L戊二醛溶液40μL，室温振荡2h，即获得2H4-KLH，5D3-KLH和mIgG-KLH交联物。
1.2 方法
1.2.1 Ab2诱导的体液免疫应答 取100μg2H4-KLH或5D3-KLH交联物，与CFA，IFA和PBS混合物，于0，14和28d，ip免疫Balb/c小鼠，眶静脉采血，分离血清。①Ab2与靶细胞HNE2的反应性：以5×104HNE2鼻咽癌细胞/孔铺板，加1.5mL/L戊二醛溶液固定、封板。依次加入对倍系列稀释的Ab2免疫血清(Ab3)(每孔100μL，37℃2h，PBS-Tween20洗板)，HRP-兔抗鼠IgG+A+M(ZymedLab)(37℃2h，洗板)和底物ABTS(显色20min)，用ELX800型酶标仪(Bio-Tek)测定A405nm。②Ab2与酶标记Ab1对靶抗原的竞争性：用对倍系列稀释的Ab2免疫血清(Ab3)加入96孔HNE2细胞板(每孔50μL)，同时加等量酶标记的Ab1，37℃2h，洗板，加底物ABTS显色20min，测定A405nm。③HNE2细胞粗抗原的Westernblot分析〔3〕：用溶解缓冲液提取HNE2细胞粗抗原，再用75g/L分离胶和50g/L浓缩胶的不连续解离缓冲系统进行SDS-PAGE，稳流50mA，于15℃电泳约2.5h。电泳后，制成由转移缓冲液浸湿的滤纸、硝酸纤维膜(nitrocellulose membrane,NC膜)和凝胶组成的转移单位，于15℃在0.8mA/cm2的条件下，进行半干湿法电泳转移约1h。将转移后的NC膜用Ab1和Ab3免疫染色，根据相对迁移率分别计算Ab1和Ab3所识别的抗原的Mr。
, 百拇医药
1.2.2 Ab2诱导的细胞免疫应答 ①迟发型超敏反应(DTH)〔4〕:将8～10wk龄Balb/c小鼠随机分成实验一组、二组和对照组。实验组分别在0，14和28d，用100μg2H4-KLH交联物(一组)或5D3-KLH交联物(二组)与等体积CFA，IFA和PBS的混合物ip。50d后，用200Gy60Coγ射线照射过的人鼻咽癌细胞HNE2和人B淋巴细胞分别注射于小鼠的右、左后足垫，细胞数为5×105，体积为20μL，对照组小鼠除用mIgG-KLH免疫外，其余完全同实验组。在注射前及注射后24，48和72h，分别用0.02mm千分尺测量足垫厚度。将右后足垫的厚度减去其注射前的厚度与左后足垫的厚度减去其注
射前厚度的差值即为肿大的程度。结果以平均值±标准差表示，用完全随机设计的两样本均数比较的t检验做统计学分析。②脾细胞增殖试验〔5〕：将2H4-KLH和5D3-KLH交联物分别与CFA混合，充分乳化后，分别通过腹腔注射免疫Balb/c小鼠。于第14天，用相同免疫原的IFA混合物加强注射，两周后拉颈处死小鼠，无菌取脾脏制成单个细胞悬液，用含100mL/L小牛血清的DMEM调整细胞浓度至5×108/L，分配于96孔细胞板，每孔100μL。每4孔作为一组平行孔，每孔加入100μL含104预先用60C0γ射线200Gy照射过的人鼻咽癌相关抗原阳性细胞(HNE2)，或大肠癌细胞株HRT-18，或100μL含200ng的无菌纯化抗独特型抗体(2H4/5D3)，或无关抗体(抗人大肠癌的鼠mAbHb3)；空白对照加100μLDMEM。将细胞置50mL/LCO2孵箱培养5d后，每孔加入37kBq[3H]-TdR培养24h，收集细胞于玻璃纤维纸上，自然干燥后，置滤纸于盛有闪烁液的测量杯内，用液闪计数器计数cpm值。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 Ab2的纯化与检测 2H4，5D3腹水经硫酸铵盐析再过Sephacryl S-300HR柱层析，获得高纯度、高抗体活性的纯化Ab2。①ELISA检测：将以Ab2免疫小鼠获得的抗血清(Ab3)对倍系列稀释后，用ELISA检测其与靶细胞HNE2的反应性。结果显示，Ab22H4或5D3免疫小鼠产生的Ab3可特异性地与HNE2细胞结合(图1)。用竞争抑制试验检测Ab3与相应Ab1(FC2/HNL5)竞争鼻咽癌细胞上抗原的结果显示，当采用一定量的酶标记Ab1(12mg/L)时，随着相对应的Ab3血清浓度的下降，A405nm值则随之上升，呈剂量依赖关系(图2)。这表明多克隆Ab3可与Ab1结合相同的抗原，具有相同的独特位，从而间接证明Ab2(2H4/5D3)属于β型抗独特型抗体。②Westernblot分析：将从HNE2细胞提取的粗抗原经SDS-PAGE后进行免疫印迹，NC膜用丽春红-S染色发现，粗抗原溶液显示数条区带，用Ab3和Ab1进行免疫酶检测，发现FC2(Ab1)与2H4免疫血清(Ab3)识别的抗原相同，Mr约68000；HNL-5(Ab1)与用5D3免疫的血清(Ab3)亦可作用于相同的抗原决定簇(Mr约80000)(图3)。
, 百拇医药
图1 Ab3与HNE2细胞结合反应的检测
Fig1 The detection of Ab3 binding to HNE2 cells
图2 Ab3与Ab1竞争HNE2细胞上抗原的竞争抑制试验
Fig2 The competitive inhibition test of Ab3-containing sera
with Ab1 for tumor associated antigen on HNE2 cells
图3 HNE2细胞提取的粗抗原的免疫印迹分析
, 百拇医药
Fig3 Western blot analysis of crude antigen extracted from HNE2 cells
A:Standard molecular protein(Mr);B:mAb FC2;C:Ab3 sera primed
with 2H4;D:mAb HNL 5;E:Ab3 sera primed with 5D3.
2.2 Ab2诱导细胞介导的免疫应答 ①DTH：以人肿瘤细胞作为刺激细胞攻击经Ab2免疫的Balb/c小鼠，观察局部的DTH。计算公式：以注射肿瘤细胞(HNE2)的小鼠右后足垫厚度与注射前厚度的差值减去注射人B淋巴细胞的小鼠左后足垫厚度与注射前的差值，即为肿大程度的数值。实验1组(2H4免疫，n=10):48h的肿大为(65±15)×10-2mm；实验2组(5D3免疫，n=10):48h的肿大为(55±19)×10-2mm，对照组(mIgG免疫，n=9)；48h的肿大为(7±4)×10-2mm。实验1组与对照组相比较，有极显著的差异(t1=11.3114,P1<0.001)；实验2组与对照组相比较，亦有极显著的差异(t2=7.5815,P1<0.002)，说明2H4/5D3能特异性地诱导对鼻咽癌细胞的DTH反应，并可持续72h(图4)。②T细胞增殖试验用2H4-KLH,5D3-KLH和mIgG-KLH交联物免疫小鼠，再在体外用靶细胞(HNE2)和无关肿瘤细胞(HRT-18)刺激免疫脾T细胞。结果发现，经靶细胞刺激后，Ab2免疫的脾T细胞的增殖反应显著高于mIgG免疫的脾T细胞(t1=27.5548,P1<0.001;t2=7.7784，P1<0.001)；而对无关肿瘤细胞的刺激无差异(t1=0.3620,P1>0.5;t2=1.3595,P2>0.2)。同样，Ab2免疫的脾T细胞经Ab2再次刺激后，其增殖反应亦显著高于mIgG免疫的脾T细胞；而对无关抗体(Hb3)的刺激，各组免疫脾细胞的增殖反应无差异(表1)。说明免疫脾细胞对特异抗原的刺激具有明显的增 殖反应，而对非相关抗原的刺激则不出现细胞增殖。
, http://www.100md.com
图4 Ab2诱导的迟发型超敏反应
Fig4 DTH induced by Ab2
表1 3组小鼠脾细胞的增殖试验
Tab1 Proliferative test of splenocytes from 3 group mice Stimulator
cpm value
2H4-immunized
group(1)
5D3-immunized
group(2)
mouse IgG-immunized
, http://www.100md.com
group(3)
Blank group
133±15a
140±8a
149±8
HNE2(104)
1226±56b
1229±99b
275±41
HRT-18(104)
, http://www.100md.com
316±18a
340±30a
309±34
2H4(10mg/L)
1286±78b
815±17b
430±31
5D3(10mg/L)
896±46b
1309±107b
, 百拇医药
449±41
Hb3(10mg/L)
330±51a
316±39a
382±37
aP>0.05,bP<0.001vs(1)or(2).
3 讨论
抗独特型抗体作为分子模拟物已广泛应用于新一代疫苗的研制〔6〕，并用作生物受体的探针〔7〕、肿瘤的免疫治疗〔8，9〕等。我们的目的是，证实Ab22H4和5D3能否成为肿瘤的治疗制剂或为肿瘤疫苗提供依据。由于2H4和5D3为抗原的内影像，故必然能够模拟抗原诱导机体产生特异性的抗体应答，即产生Ab3。以2H4和5D3免疫同系动物诱导产生的Ab3，能与鼻咽癌细胞上的相应抗原结合。Westernblot分析显示，FC2(Ab1)和2H4免疫的Ab3均能识别Mr68000的抗原，且不同于HNL5(Ab1)和5D3免疫的Ab2所识别的抗原(Mr80000)，提示2H4和5D3均能诱导体液免疫应答，但模拟的鼻咽癌相关抗原不同。
, 百拇医药
同样，抗独特型抗体也应能够诱导细胞介导的免疫应答，通过检测局部的DTH和T细胞增殖反应试验可以证实。我们用Ab2免疫小鼠后再用鼻咽癌细胞进行攻击，注射局部出现DTH，反应可持续72h，以48h最为明显。另外，用免疫脾细胞在体外用抗原特异性肿瘤细胞或模拟抗原Ab2刺激后，出现显著的细胞增殖。以上结果说明，2H4和5D3均可模拟鼻咽癌相关抗原，使免疫小鼠产生对鼻咽癌相关抗原的特异性细胞免疫应答。
基金项目：国家自然科学基金资助,No.39270706
作者简介：李官成，男，39岁，副教授，医学博士长沙市开福区湘雅路88号,Tel.(0731)4805445 2000byJCellMolImmunolPresswww.immunology.net/jcmi;Email.immuedit@fmmu.edu.cn
参考文献：
, 百拇医药
〔1〕 Moudgil KD,Sercarz EE. Can antitumor immune responses discriminate between self and nonself〔J〕Immunol Today, 1994;15:353- 355.
〔2〕 Hanna N, Kripke ML. Immunologic significance of nonspecific suppressor cells in spleens of tumor- bearing mice〔 J〕 . Cell Immunol, 1979;43(2):293- 303.
〔 3〕 李官成，孙去病.肿瘤相关抗原CA Hb3对大肠癌血清学诊断的价值〔J〕. 中国肿瘤临床 ， 1996； 23(3):173- 177.
〔4〕 Chen ZJ, Yang H, Ferrone S. Human high moleular weight mela- noma- associated antigen mimicry by mouse anti- idiotypic monoclonal antibody MK2-23〔J〕 . J Immunol, 1991;147:1082- 1090.
, 百拇医药
〔5〕 Durrant LG, Denton GWL, Jacobs E, et al. An idiotypic replicon of carcinoembryonic antigen inducing cellular and humoral responses directed against human colorectal tumor〔J〕 . Int J Cancer, 1992;50:811- 816.
〔6〕 Su S, Ward MM, Apicella MA, et al. A nontoxic, idiotope vaccine against Gram- negative bacterial infections〔J〕 . J Immunol, 1992;148:234- 238.
〔7〕 Jennings IL, Kemp BE, Cotton RGH. Localization of cofactor binding sites with monoclonal anti- idiotype antibodies: phenylalanine hydroxylase〔 J〕 . Proc Natl Acad Sci USA, 1991;88:5734- 5738.
, 百拇医药
〔8〕 Schultes BC, Baum RP, Niesen A, et al. Anti- idiotype induction therapy: anti- CA125 antibodies (Ab3)mediated tumor killing in patients treated with ovarex mAb B43.13(Ab1)〔 J〕 . Cancer Immunol Immunother,1998;46:201- 212.
〔9〕 Foon KA, Sen G, Hutchins L, et al. Antibody responses in melanoma patients immunized with an anti- idiotype antibody mimicking disialoganglioside GD2〔J〕 . Clin Cancer Res,1998;4:1117- 1124.
收稿日期：1999-07-19
修回日期：1999-10-14, http://www.100md.com