B细胞对T细胞及其亚群CD25、CD30表达的影响
作者：黄瑾 安东善 卓仁淑 图门乌力吉 林树青3r, http://www.100md.com
单位：黄瑾(白求恩医科大学第二临床医院呼吸内科，吉林 长春 130041)； 图门乌力吉(白求恩医科大学第二临床医院呼吸内科，吉林 长春 130041)； 林树青(白求恩医科大学第二临床医院呼吸内科，吉林 长春 130041)； 安东善(吉林省人民医院老年病科，吉林 长春 130022)； 卓仁淑(吉林市妇产科医院药剂科，吉林 吉林 132000)3r, http://www.100md.com
关键词：B淋巴细胞；T淋巴细胞；CD25；CD30；抗原提呈3r, http://www.100md.com
免疫学杂志000111 摘 要：目的 探讨B淋巴细胞对T淋巴细胞的抗原提呈作用。方法 分离外周血T、B细胞及CD4+、CD8+T淋巴细胞，分别用LPS、PPD、PWM刺激B细胞，洗去刺激原后与T细胞及亚群共同培养。最后用流式细胞仪检测T细胞及其亚群CD25、CD30表达水平。结果 PPD刺激组T细胞CD25、CD30表达水平明显升高，而PWM、LPS刺激组与对照组间无差异(P>0.05)。PPD刺激组CD4+T细胞CD25、CD30表达与对照组间有显著差异(P<0.05)，但CD8+T细胞与对照组间无差异；LPS、PWM刺激组与对照组间无差异。结论 ①未受抗原刺激的B细胞对T细胞活化无明显影响；②受PPD刺激的B细胞对T细胞的活化有明显促进作用；③受PPD刺激的B细胞对CD4+T细胞活化有更明显的促进作用。3r, http://www.100md.com
中图分类号：R392.11；R392.12 文献标识码：A3r, http://www.100md.com
Effect of human B cells to CD25，CD30 expression on T lymphocytes and T lymphocyte subsets3r, http://www.100md.com
HUANG Jin TUMEN Wu-liji Lin Shu-qing3r, http://www.100md.com
(Department of Respiratory Medicine，the Second Clinical College，Norman Bethune University of Medical Science，Changchun 130041，China)
AN Dong-shan(Department of Gerontology，Jilin Province Hospital，Chang-chun 130022，China)ZHUO Ren-shuyee, 百拇医药
(Pharmacy of Hospital for Gynaecology and Obstetrics of Jilin City，Jilin 132000，China)yee, 百拇医药
Abstract：Objective To evaluate antigen presentation function of B cells to T cells and their subsets.Methods We isolated peripheral blood T、B cells and CD4+，CD8+ T cells respectively.B cells were stimulated by LPS、PPD and PWM and incubated with T cells and T cell subsets. The expression of CD25、CD30 on T cells and T cell subsets were detected with flow cytometric analysis. Results The levels of CD25 and CD30 expression on T cells and CD4+T cells in PPD-stimulated group were significantly higher than controls while there was no statistical difference between PWM ，LPS-stimulated groups and controls. Conclusion PPD-stimulated B cells can promote T cells， especially CD4+ T cells activation.yee, 百拇医药
Key words：B lymphocytes； T lymphocytes； CD25；CD30；antigen presentation▲yee, 百拇医药
在免疫系统中，T细胞为最重要的免疫细胞之一。T细胞活化需要抗原提呈细胞的抗原提呈作用。过去一直认为，单核/巨噬细胞在抗原提呈中占有重要地位。新近发现：B细胞具有反向抗原提呈功能[1]，是T细胞活化的另一重要途径。关于B细胞抗原提呈方面的研究报道，为数不多，且多以鼠细胞或人B淋巴细胞瘤细胞株以及脾、腹腔B细胞为研究对象。本研究以人外周血B细胞对T细胞及其亚群的抗原提呈作用为题，探讨B细胞的抗原提呈作用。
1 料和方法%., http://www.100md.com
1.1 研究 对象 20例均为长春市中心血站健康献血员。其中男12例，女8例。年龄21～38岁，平均年龄30岁。%., http://www.100md.com
1.2 主要试剂及仪器 PPD由长春生物制品研究所生产；PWM由美国Sigma公司提供；PHA购自广州医药工业研究所；鼠抗人CD4及CD8单抗由北京医科大学免疫室提供；鼠抗人CD25单抗为美国COULTER公司产品；鼠抗人CD30单抗由美国ZYMED公司提供；磁标抗鼠IgG单抗为法国IMMUNOTECH公司产品；FITC标记抗鼠IgG单抗由天津血液病研究所提供；elite型流式细胞仪由美国COULTER公司生产。%., http://www.100md.com
1.3 方法%., http://www.100md.com
1.3.1 单抗及刺激原浓度的确定：抗CD25单抗浓度的选择，将细胞悬液加入24孔培养板，1 000μl/孔；各孔加入抗CD25单抗，终浓度分别为1∶80，1∶40，1∶20，1∶10；加入FITC标记二抗后用流式细胞仪检测CD25表达水平。CD30单抗浓度的选择，除所加终浓度分别为1∶500，1∶250，1∶125，1∶62.5外，余同CD25。PPD浓度的选择，105 B细胞悬液中的PPD终浓度分别为1.25、2.5、5、10IU/ml。洗去PPD，与T细胞共同培养，检测细胞CD25、CD30的表达水平。所用LPS终浓度为6.25、12.5、25、50U/ml；PWM终浓度为0.1、1.0、10、100μg/ml，余同PPD。%., http://www.100md.com
1.3.2 外周血单个核细胞的分离：无菌取血10ml，肝素抗凝。用淋巴细胞分离液分离，最后用IMDM——全培养基调成1ml细胞悬液备用。%., http://www.100md.com
1.3.3 单核细胞的去除：将1ml单个核细胞悬液倒入无菌平皿，60min后吸取未贴壁细胞备用，弃贴壁之单核细胞。%., http://www.100md.com
1.3.4 T、B淋巴细胞的分离：采用呢绒毛柱法。将1ml细胞悬液加入已用Hank’s处理的长100mm、直径3mm米的尼龙毛柱中，60 min后Hank’s洗柱，自然流出部分为T细胞，经挤压后流出部分为B细胞。1 000r/min离心10min，弃上清，调成细胞悬液备用。%., http://www.100md.com
1.3.5 CD4+及CD8+T淋巴细胞的分离：将T细胞悬液分别加入抗CD4、CD8单抗置室温30 min后，加入磁标抗IgG单抗，室温反应10 min。继之室温下磁铁吸引10 min。用吸管轻轻吸取未附壁之细胞悬液。1 000 r/min，离心10 min，弃上清，调成细胞悬液。
1.3.6 细胞培养：分别用LPS、PPD、PWM刺激B细胞48h，然后洗去抗原，与T细胞置37°C细胞培养箱共同培养24h。?[, 百拇医药
1.3.7 CD25、CD30的检测：向T、B细胞悬液内加入FITC标记的抗人IgG单抗，避光置室温30 min。Hank’s洗涤两次，加入600 μl PBS，调成悬液，最后用流式细胞仪检测。?[, 百拇医药
1.4 统计学分析 数据用
±s表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为显著性水平。?[, 百拇医药
2 结果?[, 百拇医药
2.1 主要实验影响因素的选择 抗CD25单抗浓度在1∶20至1∶10之间CD25表达水平相差无几，本实验选用1∶20终浓度。依此类推，抗CD30单抗选用1∶125终浓度；PPD用50IU/ml终浓度；LPS用25U/ml终浓度；PWM用10μg/ml。?[, 百拇医药
2.2 T细胞CD25、CD30表达情况 见图1。PPD刺激组与对照组比较，T细胞CD25、CD30表达水平有显著差异(P<0.05)；PWM、LPS刺激组与对照组间CD25、CD30表达无差异。
?[, 百拇医药
图1 B淋巴细胞对T淋巴细胞活化的影响?[, 百拇医药
Fig1 The effect of B cell to T cell activation?[, 百拇医药
2.3 T细胞亚群CD25、CD30表达情况 见图2。PPD组CD4+T细胞CD25、CD30表达与对照组间有显著差异(P<0.05)，但CD8+T细胞与对照组间无差异(P>0.05)；PWM、LPS刺激组与对照组间无差异。
?[, 百拇医药
图2 B淋巴细胞对不同T淋巴细胞亚群CD30表达的影响?[, 百拇医药
Fig2 The effect of B cell to CD30 expression on T cell subsets
3 讨论4q, 百拇医药
抗原提呈是抗原提呈细胞对抗原进行摄取加工之后，提呈给淋巴细胞，使之活化、增殖、分化的过程。CD25，即IL-2Ra，自1979年BONNARD[2]等人从体外培养的CTC(human cultured T cell)上发现以来，对CD25进行了深入研究。目前已明确CD25主要表达于成熟的活化T细胞，因而可做为T细胞活化指标。CD30是最初发现于何杰金氏病(Hodgkin’s disease)中的里丝氏细胞(Reed Sternberg cell)上的跨膜糖蛋白[3]。近年发现活化T细胞也表达该分子[4，5]。因而本实验采用CD25、CD30这两个T细胞活化指标。4q, 百拇医药
我们的研究结果提示：①受PPD刺激的B细胞使T细胞CD25、CD30表达明显增加，而PWM、LPS刺激组则无变化。说明PPD做为特异性抗原经B细胞的摄取、加工，将抗原决定簇传递给了T细胞，也可能是受PPD刺激后B细胞分泌多种细胞因子作用于T细胞使之活化。但LPS、PWM做为另一种活化T细胞的因素，未能出现与PPD刺激组相同的结果。出现这种情况可能与B细胞对提呈特异性与非特异性抗原机制不同有关。KAKIUCHI [6]用可逆的蛋白合成抑制剂——吐根碱能抑制特异性抗原的胞内加工过程，而对非特异性抗原的加工过程则无影响。从而得出特异性抗原的加工过程不同于非特异性抗原的结论。GRIVEL [7]认为B细胞只有轻微的对可溶性抗原和脂质体包绕的抗原的提呈功能。但如为特异性抗原，那么B细胞膜表面免疫球蛋白将对该抗原加以有效的提呈。②PPD刺激组CD4+T细胞表达CD25水平明显增强，但CD8+T细胞CD25表达则无上调。这种不同结果可能与CD8+T细胞活化不仅需要有抗原的存在，还需活化之Th细胞产生的IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-9等的生物学活性有关。而本实验CD4+与CD8+T细胞已相互分离，为上述推测提供了依据。4q, 百拇医药
总之，我们的研究证明：①未受抗原刺激的B细胞对T细胞活化无明显影响。②受PPD刺激的B细胞对T细胞的活化有明显促进作用。③受PPD刺激的B细胞对CD4+T细胞有更明显的活化作用。■4q, 百拇医药
作者简介：黄瑾(1960-)，男，吉林市人，教授，硕士，主要从事哮喘发病机制的研究。
参考文献：&|, 百拇医药
[1]毕爱华.医学免疫学[M].北京：人民军医出版社，1995.22～23.&|, 百拇医药
[2]杨贵贞.免疫生物工程纲要与技术[M].长春：吉林科学技术出版社，1991，121.&|, 百拇医药
[3]SCHWAB U， STEIN H， GERDS J，et al.Production of a monoclonal antibody specific for Hodgkin’s disease and a sunset of normal lymphoid cells[J]. Nature， 1982，299：65～70.&|, 百拇医药
[4]ELLIS TM， SIMMS PE，SLIVINICK DK，et al. CD30 is a signal-transducing molecule that defines a sunset of human activated CD45RO+T cell[J]. J Immunol， 1993，151：2380～2389.&|, 百拇医药
[5]HAMANN D， HILKENS CMU，GROGAN JL， et al. CD30 Expression does not discriminate between human Th1-and Th2-Type T cell[J]. J Immunol， 1996，156(4)：1387～1391.&|, 百拇医药
[6]KAKIUCHI T， WATANABE M， HOZUMI N， et al. Differential sensitivity of specific and nonspecific antigen-presentation by B cell to a protein synthesis inhibitor[J]. J Immunol， 1990，145(6)：1653～1658.&|, 百拇医药
[7]GRIVEL JC， GROOK K， LESERMAN L，et al. Endocytosis and presentation of liposome-associated antigens by B cells[J]. Immunomethods， 1994，4(3)：223～228.&|, 百拇医药
收稿日期：1999-06-30&|, 百拇医药
修回日期：1999-09-21(黄瑾 安东善 卓仁淑 图门乌力吉 林树青)
单位：黄瑾(白求恩医科大学第二临床医院呼吸内科，吉林 长春 130041)； 图门乌力吉(白求恩医科大学第二临床医院呼吸内科，吉林 长春 130041)； 林树青(白求恩医科大学第二临床医院呼吸内科，吉林 长春 130041)； 安东善(吉林省人民医院老年病科，吉林 长春 130022)； 卓仁淑(吉林市妇产科医院药剂科，吉林 吉林 132000)3r, http://www.100md.com
关键词：B淋巴细胞；T淋巴细胞；CD25；CD30；抗原提呈3r, http://www.100md.com
免疫学杂志000111 摘 要：目的 探讨B淋巴细胞对T淋巴细胞的抗原提呈作用。方法 分离外周血T、B细胞及CD4+、CD8+T淋巴细胞，分别用LPS、PPD、PWM刺激B细胞，洗去刺激原后与T细胞及亚群共同培养。最后用流式细胞仪检测T细胞及其亚群CD25、CD30表达水平。结果 PPD刺激组T细胞CD25、CD30表达水平明显升高，而PWM、LPS刺激组与对照组间无差异(P>0.05)。PPD刺激组CD4+T细胞CD25、CD30表达与对照组间有显著差异(P<0.05)，但CD8+T细胞与对照组间无差异；LPS、PWM刺激组与对照组间无差异。结论 ①未受抗原刺激的B细胞对T细胞活化无明显影响；②受PPD刺激的B细胞对T细胞的活化有明显促进作用；③受PPD刺激的B细胞对CD4+T细胞活化有更明显的促进作用。3r, http://www.100md.com
中图分类号：R392.11；R392.12 文献标识码：A3r, http://www.100md.com
Effect of human B cells to CD25，CD30 expression on T lymphocytes and T lymphocyte subsets3r, http://www.100md.com
HUANG Jin TUMEN Wu-liji Lin Shu-qing3r, http://www.100md.com
(Department of Respiratory Medicine，the Second Clinical College，Norman Bethune University of Medical Science，Changchun 130041，China)
AN Dong-shan(Department of Gerontology，Jilin Province Hospital，Chang-chun 130022，China)ZHUO Ren-shuyee, 百拇医药
(Pharmacy of Hospital for Gynaecology and Obstetrics of Jilin City，Jilin 132000，China)yee, 百拇医药
Abstract：Objective To evaluate antigen presentation function of B cells to T cells and their subsets.Methods We isolated peripheral blood T、B cells and CD4+，CD8+ T cells respectively.B cells were stimulated by LPS、PPD and PWM and incubated with T cells and T cell subsets. The expression of CD25、CD30 on T cells and T cell subsets were detected with flow cytometric analysis. Results The levels of CD25 and CD30 expression on T cells and CD4+T cells in PPD-stimulated group were significantly higher than controls while there was no statistical difference between PWM ，LPS-stimulated groups and controls. Conclusion PPD-stimulated B cells can promote T cells， especially CD4+ T cells activation.yee, 百拇医药
Key words：B lymphocytes； T lymphocytes； CD25；CD30；antigen presentation▲yee, 百拇医药
在免疫系统中，T细胞为最重要的免疫细胞之一。T细胞活化需要抗原提呈细胞的抗原提呈作用。过去一直认为，单核/巨噬细胞在抗原提呈中占有重要地位。新近发现：B细胞具有反向抗原提呈功能[1]，是T细胞活化的另一重要途径。关于B细胞抗原提呈方面的研究报道，为数不多，且多以鼠细胞或人B淋巴细胞瘤细胞株以及脾、腹腔B细胞为研究对象。本研究以人外周血B细胞对T细胞及其亚群的抗原提呈作用为题，探讨B细胞的抗原提呈作用。
1 料和方法%., http://www.100md.com
1.1 研究 对象 20例均为长春市中心血站健康献血员。其中男12例，女8例。年龄21～38岁，平均年龄30岁。%., http://www.100md.com
1.2 主要试剂及仪器 PPD由长春生物制品研究所生产；PWM由美国Sigma公司提供；PHA购自广州医药工业研究所；鼠抗人CD4及CD8单抗由北京医科大学免疫室提供；鼠抗人CD25单抗为美国COULTER公司产品；鼠抗人CD30单抗由美国ZYMED公司提供；磁标抗鼠IgG单抗为法国IMMUNOTECH公司产品；FITC标记抗鼠IgG单抗由天津血液病研究所提供；elite型流式细胞仪由美国COULTER公司生产。%., http://www.100md.com
1.3 方法%., http://www.100md.com
1.3.1 单抗及刺激原浓度的确定：抗CD25单抗浓度的选择，将细胞悬液加入24孔培养板，1 000μl/孔；各孔加入抗CD25单抗，终浓度分别为1∶80，1∶40，1∶20，1∶10；加入FITC标记二抗后用流式细胞仪检测CD25表达水平。CD30单抗浓度的选择，除所加终浓度分别为1∶500，1∶250，1∶125，1∶62.5外，余同CD25。PPD浓度的选择，105 B细胞悬液中的PPD终浓度分别为1.25、2.5、5、10IU/ml。洗去PPD，与T细胞共同培养，检测细胞CD25、CD30的表达水平。所用LPS终浓度为6.25、12.5、25、50U/ml；PWM终浓度为0.1、1.0、10、100μg/ml，余同PPD。%., http://www.100md.com
1.3.2 外周血单个核细胞的分离：无菌取血10ml，肝素抗凝。用淋巴细胞分离液分离，最后用IMDM——全培养基调成1ml细胞悬液备用。%., http://www.100md.com
1.3.3 单核细胞的去除：将1ml单个核细胞悬液倒入无菌平皿，60min后吸取未贴壁细胞备用，弃贴壁之单核细胞。%., http://www.100md.com
1.3.4 T、B淋巴细胞的分离：采用呢绒毛柱法。将1ml细胞悬液加入已用Hank’s处理的长100mm、直径3mm米的尼龙毛柱中，60 min后Hank’s洗柱，自然流出部分为T细胞，经挤压后流出部分为B细胞。1 000r/min离心10min，弃上清，调成细胞悬液备用。%., http://www.100md.com
1.3.5 CD4+及CD8+T淋巴细胞的分离：将T细胞悬液分别加入抗CD4、CD8单抗置室温30 min后，加入磁标抗IgG单抗，室温反应10 min。继之室温下磁铁吸引10 min。用吸管轻轻吸取未附壁之细胞悬液。1 000 r/min，离心10 min，弃上清，调成细胞悬液。
1.3.6 细胞培养：分别用LPS、PPD、PWM刺激B细胞48h，然后洗去抗原，与T细胞置37°C细胞培养箱共同培养24h。?[, 百拇医药
1.3.7 CD25、CD30的检测：向T、B细胞悬液内加入FITC标记的抗人IgG单抗，避光置室温30 min。Hank’s洗涤两次，加入600 μl PBS，调成悬液，最后用流式细胞仪检测。?[, 百拇医药
1.4 统计学分析 数据用
±s表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为显著性水平。?[, 百拇医药2 结果?[, 百拇医药
2.1 主要实验影响因素的选择 抗CD25单抗浓度在1∶20至1∶10之间CD25表达水平相差无几，本实验选用1∶20终浓度。依此类推，抗CD30单抗选用1∶125终浓度；PPD用50IU/ml终浓度；LPS用25U/ml终浓度；PWM用10μg/ml。?[, 百拇医药
2.2 T细胞CD25、CD30表达情况 见图1。PPD刺激组与对照组比较，T细胞CD25、CD30表达水平有显著差异(P<0.05)；PWM、LPS刺激组与对照组间CD25、CD30表达无差异。
?[, 百拇医药图1 B淋巴细胞对T淋巴细胞活化的影响?[, 百拇医药
Fig1 The effect of B cell to T cell activation?[, 百拇医药
2.3 T细胞亚群CD25、CD30表达情况 见图2。PPD组CD4+T细胞CD25、CD30表达与对照组间有显著差异(P<0.05)，但CD8+T细胞与对照组间无差异(P>0.05)；PWM、LPS刺激组与对照组间无差异。
?[, 百拇医药图2 B淋巴细胞对不同T淋巴细胞亚群CD30表达的影响?[, 百拇医药
Fig2 The effect of B cell to CD30 expression on T cell subsets
3 讨论4q, 百拇医药
抗原提呈是抗原提呈细胞对抗原进行摄取加工之后，提呈给淋巴细胞，使之活化、增殖、分化的过程。CD25，即IL-2Ra，自1979年BONNARD[2]等人从体外培养的CTC(human cultured T cell)上发现以来，对CD25进行了深入研究。目前已明确CD25主要表达于成熟的活化T细胞，因而可做为T细胞活化指标。CD30是最初发现于何杰金氏病(Hodgkin’s disease)中的里丝氏细胞(Reed Sternberg cell)上的跨膜糖蛋白[3]。近年发现活化T细胞也表达该分子[4，5]。因而本实验采用CD25、CD30这两个T细胞活化指标。4q, 百拇医药
我们的研究结果提示：①受PPD刺激的B细胞使T细胞CD25、CD30表达明显增加，而PWM、LPS刺激组则无变化。说明PPD做为特异性抗原经B细胞的摄取、加工，将抗原决定簇传递给了T细胞，也可能是受PPD刺激后B细胞分泌多种细胞因子作用于T细胞使之活化。但LPS、PWM做为另一种活化T细胞的因素，未能出现与PPD刺激组相同的结果。出现这种情况可能与B细胞对提呈特异性与非特异性抗原机制不同有关。KAKIUCHI [6]用可逆的蛋白合成抑制剂——吐根碱能抑制特异性抗原的胞内加工过程，而对非特异性抗原的加工过程则无影响。从而得出特异性抗原的加工过程不同于非特异性抗原的结论。GRIVEL [7]认为B细胞只有轻微的对可溶性抗原和脂质体包绕的抗原的提呈功能。但如为特异性抗原，那么B细胞膜表面免疫球蛋白将对该抗原加以有效的提呈。②PPD刺激组CD4+T细胞表达CD25水平明显增强，但CD8+T细胞CD25表达则无上调。这种不同结果可能与CD8+T细胞活化不仅需要有抗原的存在，还需活化之Th细胞产生的IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-9等的生物学活性有关。而本实验CD4+与CD8+T细胞已相互分离，为上述推测提供了依据。4q, 百拇医药
总之，我们的研究证明：①未受抗原刺激的B细胞对T细胞活化无明显影响。②受PPD刺激的B细胞对T细胞的活化有明显促进作用。③受PPD刺激的B细胞对CD4+T细胞有更明显的活化作用。■4q, 百拇医药
作者简介：黄瑾(1960-)，男，吉林市人，教授，硕士，主要从事哮喘发病机制的研究。
参考文献：&|, 百拇医药
[1]毕爱华.医学免疫学[M].北京：人民军医出版社，1995.22～23.&|, 百拇医药
[2]杨贵贞.免疫生物工程纲要与技术[M].长春：吉林科学技术出版社，1991，121.&|, 百拇医药
[3]SCHWAB U， STEIN H， GERDS J，et al.Production of a monoclonal antibody specific for Hodgkin’s disease and a sunset of normal lymphoid cells[J]. Nature， 1982，299：65～70.&|, 百拇医药
[4]ELLIS TM， SIMMS PE，SLIVINICK DK，et al. CD30 is a signal-transducing molecule that defines a sunset of human activated CD45RO+T cell[J]. J Immunol， 1993，151：2380～2389.&|, 百拇医药
[5]HAMANN D， HILKENS CMU，GROGAN JL， et al. CD30 Expression does not discriminate between human Th1-and Th2-Type T cell[J]. J Immunol， 1996，156(4)：1387～1391.&|, 百拇医药
[6]KAKIUCHI T， WATANABE M， HOZUMI N， et al. Differential sensitivity of specific and nonspecific antigen-presentation by B cell to a protein synthesis inhibitor[J]. J Immunol， 1990，145(6)：1653～1658.&|, 百拇医药
[7]GRIVEL JC， GROOK K， LESERMAN L，et al. Endocytosis and presentation of liposome-associated antigens by B cells[J]. Immunomethods， 1994，4(3)：223～228.&|, 百拇医药
收稿日期：1999-06-30&|, 百拇医药
修回日期：1999-09-21(黄瑾 安东善 卓仁淑 图门乌力吉 林树青)