癌胚抗原cDNA真核表达重组质粒的构建
作者：卢方安 杨 洁 罗超权 杨英洁
单位：卢方安 郧阳医学院生化教研室 十堰 442000 ；杨 洁 罗超权 杨英洁 中山医科大学生化教研室
关键词：癌胚抗原；逆转录病毒属，MLV相关；遗传载体；基因；克隆，分子；质粒
郧阳医学院学报990201摘 要 目的：将人特异表达的癌胚抗原(CEA)-cDNA克隆到逆转录病毒质粒载体pLXSN中，构建成真核表达重组质粒pLXSN-CEA，为进一步表达表达人CEA的动物肿瘤细胞模型作准备。方法：用内切酶EcoRI酶切质粒pLXSN及p91023B-CEA-17，得到线状载体pLXSN及外源基因CEA-cDNA，然后通过连接酶的连接反应将CEA-cDNA插入到pLXSN的EcoRI位点，用EcoRI和BamHI鉴定。结果：成功地将CEA-cDNA克隆到pLXSN中，通过鉴定筛选获得有意义的正向重组质粒pLXSN-CEA。结论：利用基因克隆技术能将人CEA-cDNA定向插入逆转录病毒质粒载体中，构建成真核表达重组质粒pLXSN-CEA，为进一步建立CEA阳性动物肿瘤细胞模型及研究CEA阳性肿瘤的免疫防治奠定了基础。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 Q784
Construction of CEA-cDNA Eukaryotic
Expression Recombinant Plasmid
Lu Fangan，Yangjie,Luo Chaoquan,et al
(Department of Biochemistry,Yunyang Medical College,Shiyan 442000)
Abstract Objective:The cDNA of the carcinoembryonic antigen(CEA) was cloned into pLXSN of the retrovirus plasmid to form eukaryotic expression recombinant plasmid,pLXSN-CEA.Methods:The pLXSN and p91023B-CEA-17 were digested with EcoRI separately,and the linear pLXSN and CEA-cDNA fragment were obtained.And then the CEA-cDNA was inserted into the pLXSN through ligation with ligase.Results:The recombinant plasmid pLXSN-CEA-cDNA was successfully cloned into the retrovirus vector plasmid pLXSN ,with the significant recombinant plasmid pLXSN-CEA obtained through screenig.Conclusion:The human gene CEA-cDNA could efficiently be inserted into retrovirus plasmid to form eukaryotic expresson recombinat plasmid pLXSN-CEA.This provides the basis for constructing animal CEA positive rumor cell model and sudying the prevention and therapy of CEA positive tumors.
, 百拇医药
Key words Carcinoembryonic Antigen;Retrovirus,MLV-Related;Genetic Vectors;Genes;cloning,Molecular;Plasmids
自1990年开始，美国有多家实验室进行了有关CEA-重组痘苗病毒的研制及其对CEA阳性肿瘤的免疫防治工作[1，2]，现已进入了Ⅰ期临床试验[3，4]，并取得了可喜的效果。我国人口众多，CEA阳性肿瘤的发病率和致死率均高。因此，本课题组率先在国内开展此项重大课题的研究，现已利用我国过去用于预防天花的痘苗病毒天坛株构建了CEA-重组痘苗病毒(CEA-rV)，并对其免疫原性和安全性进行了验证[5，6]。下一步就是要在动物模型上观察该重组病毒对CEA阳性肿瘤的防治功效。由于动物细胞不表达人癌胚抗原(CEA)[1]，因此，必须构建CEA重组质粒并将其导入动物肿瘤细胞使其有效表达CEA方能实现，本文拟将CEA-cDNA插入到逆转录病毒质粒载体pLXSN中，构建成真核表达重组质粒pLXSN-CEA，为后续实验奠定基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料来源
逆转录病毒质粒pLXSN：由Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)LTR、SV40 ori，新霉素基因neo及Ampr等部分组成，含有EcoRI和BamHI的单一酶切位点，见图1。由中山医科大学免疫学教研室王斌教授提供。
质粒p91023B-CEA-17：含人CEA-cDNA全序列，由加拿大Kaufman实验惠赠。
1.2 质粒pLXSN和p91023B-CEA-17的酶切及片段回收
采用EcoRI分别酶切，低熔点琼脂糖电泳回收线状载体pLXSN及外源基因CEA-cDNA。参照文献[7]进行。
1.3 线状质粒载体与目的基因(CEA-cDNA)片段的连接
, 百拇医药
在反应管内加酶切后线状pLXSN 200 ng，200ng CEA-cDAN，l μl 10×T4 DNA连接酶，1Weiss单位T4 DNA连接酶，然后加灭菌三蒸水至10 μl，12 ℃温育12～16 h。同时设阴阳性对照连接反应。
1.4 感受态细菌JM109的制备及连接产物的转化
参照文献[7]进行。
1.5 重组质粒的筛选鉴定
挑取培养板上各单菌落，摇床培养后抽担质粒DNA，并与原环状载体质粒一同电泳，将泳速相同者用EcoRI和BamHI酶切鉴定。
2 结果
用内切酶EcoRI酶切质粒pLXSN及p91023B-CEA-17，获得线状5.8Kb的载体pLXSN及约3Kb的CEA-cDNA片段。连接反应后的转化平板上可见有散在菌落生成。逐一挑出培养并抽提质粒DNA，将与环状载体质粒电泳同步者先用EcoRI酶切，若重组质粒则可获得5.8 Kb和3 Kb两条电泳带。然后用BamHI酶切，CEA-cDNA正向插入重组质粒可产生6.8Kb和2Kb两条带，而反向插入型重组质粒则产生7.8Kb和1Kb两条带。以此可筛选获得有意义的正向重组质粒pLXSN-CEA(图1，图2)。
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图1 CEA-cDNA重组质粒pLXSN-CEA示意图
A CEA-cDNA正向插入型重组质粒pLXSN-CEA
B CEA-cDNA反向型重组质粒pLXSN-CEA
图2 重组质粒pLXSN-CEA 酶切鉴定结果
1 重组质粒pLXSN-CEA(正)BamHI酶切
2 重组质粒pLXSN-CEA(反)BamHI酶切
3 载体质粒pLXSN BamHI酶切
4 重组质粒pLXSN-CEA(正 )EcoRI酶切
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5 载体质粒pLXSN EcoRI酶切
M DNA Marker λ DNA/HindⅢ
3 讨论
癌胚抗原(CEA)是一种重要的肿瘤相关抗原和国际公认的肿瘤标志物，其基因定位于19号染色体长臂(19q13.1～13.2),编码180KD的高度糖基化的蛋白质,存地于胃肠道等腺细胞的质膜。绝大多数结直肠癌、胃癌和胰腺癌，50%的乳腺癌及70%的非小细胞性肺癌细胞有CEA的高表达，人们称这些肿瘤为CEA阳性或表达型肿瘤[8]。由于CEA的免疫原性很弱[9]，一般不能引起机体产生有效的免疫反应，因此机体的免疫系统无法识别肿瘤细胞表面的癌胚抗原，使肿瘤细胞逃避了免疫系统的杀伤。
免疫学研究表明，将弱免疫原物质与强免疫原物质共同表达，后者可增强前者的免疫原性并有抗原提呈作用，进而透导机体产生特异性的免疫反应[5]。CEA-重组痘苗病毒技术的发展，为达此目的提供了有效的方法。国外目前已成功研制了CEA-重组痘苗病毒，并在动物实验和临床Ⅰ期试验获得可喜的效果，为CEA表达型肿瘤的免疫防治带来了希望。本课题组现已利用我国过去用于预防天花的痘苗病毒疫苗株-天坛761株构建成了CEA-重组痘苗病毒，并对其免疫原性进行了验证。为了在动物模型上观察该重组病毒对实验性CEA阳性肿瘤的免疫防治功效，必须先构建CEA重组质粒并将其导入动物肿瘤细胞建立表达人CEA的动物肿瘤细胞模型。本文即是该系列研究的前期工作。
, 百拇医药
逆转录病毒质粒pLXSN是一种常见的真核表达载体，其长末端重复序列LTR除含有病毒的大部分转录控制信号，包括启动子和聚(A)化信号外，还含有指导特异性整合的信号，所以插入的外源基因整合后仍是完整的，可以避免整合基因的重排问题[10]。本实验选择将人CEA-cNDA正向插入到pLXSN载体的EcoRI位点，构建成真核表达重组质粒pLXSN-CEA，为进一步将其导入动物肿瘤细胞建立表达CEA的动物肿瘤细胞模型作好准备。
本实验根据载体pLXSN和CEA-cDNA上酶切位点的特点，将所得重组质粒用限制酶BamHI酶切，CEA-cDNA正向插入型重组质粒酶切后产生约6.8 Kb和2Kb两条电泳带，而反向插入型则产生约7.8 Kb和1 Kb两条带，以此鉴定CEA-cDNA在载体质粒中的插入与否。实验结果表明，本实验成功地构建了CEA-cDNA逆转录病毒重组质粒，而且鉴定筛选出了有意义的CEA-cDNA正向插入型重组质粒pLXSN-CEA 。此为后续进一步建立CEA阳性动物肿瘤细胞模型及对CEA阳性肿瘤的基因免疫防治奠定了基础。
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作者简介：卢方安，男，1966年生，医学硕士，讲师
参考文献
1 Robbins PF,Kantor JA,Salgaller M，et al.Transduction and expression of the human carcinoembryonic antigen gene in a murine colon carcinoma cell line.Cancer Res,1992,51:3657
2 Kantor J,Irvine K,Abrams S，et al.Immunnogenicity and safety of a recombinant vaccinia virus expressing the carcinoembryonic antigen gene in a nonhuman.Cancer Res,1992,52:6917
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3 Tsang KY,Zaremba S,Nieroda CA，et al.Generation of human cyrotoxic T cells specific for human carcionembuyonic antigen epitopes from pations immunized with recombinant vacconia-CEA vaccine.J Natl Cancer inst,1995,87:982
4 Cole DJ,Wilson MC,Baron PL，et al.Phage I study of recombinant CEA vaccinia virus vaccine with post vacination CEA peptide challege.Hum Gene Ther,1996,7:1381
5 杨 洁，杨太成，罗超权等.表达人癌胚抗原(CEA)的重组痘苗病毒的构建。中山医科大学学报，1997，18(1)：41
, 百拇医药
6 杨 洁，赖晃文，罗超权等.人癌胚抗菌素原cDNA-重组痘苗病毒接种动物的研究.中山医科大学学报，1997，18(增刊)：41
7 金冬雁译.分子克隆实验指南.第二版.北京：科学技术出版社，1992
8 Esteban JM,Felder B, Ahn C，et al.Prognostic relevance of carcinoembryonic antigen and estrogen receptor status in breast ceacer patienst.Cancer,1994,74:1575
9 Fuchs C,Krapf F, Kern P，et al.CEA-containing immune complexes in sera of patients with colorectal and breast cancer-analysis of complexed immunoglobulin classes.Cancer Immunol Immunother,1998,26:180
10 侯云德.病毒基因工程的原理与方法.人民卫生出版社，1984
(1998-11-29 收稿), 百拇医药
单位：卢方安 郧阳医学院生化教研室 十堰 442000 ；杨 洁 罗超权 杨英洁 中山医科大学生化教研室
关键词：癌胚抗原；逆转录病毒属，MLV相关；遗传载体；基因；克隆，分子；质粒
郧阳医学院学报990201摘 要 目的：将人特异表达的癌胚抗原(CEA)-cDNA克隆到逆转录病毒质粒载体pLXSN中，构建成真核表达重组质粒pLXSN-CEA，为进一步表达表达人CEA的动物肿瘤细胞模型作准备。方法：用内切酶EcoRI酶切质粒pLXSN及p91023B-CEA-17，得到线状载体pLXSN及外源基因CEA-cDNA，然后通过连接酶的连接反应将CEA-cDNA插入到pLXSN的EcoRI位点，用EcoRI和BamHI鉴定。结果：成功地将CEA-cDNA克隆到pLXSN中，通过鉴定筛选获得有意义的正向重组质粒pLXSN-CEA。结论：利用基因克隆技术能将人CEA-cDNA定向插入逆转录病毒质粒载体中，构建成真核表达重组质粒pLXSN-CEA，为进一步建立CEA阳性动物肿瘤细胞模型及研究CEA阳性肿瘤的免疫防治奠定了基础。
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中国图书资料分类法分类号 Q784
Construction of CEA-cDNA Eukaryotic
Expression Recombinant Plasmid
Lu Fangan，Yangjie,Luo Chaoquan,et al
(Department of Biochemistry,Yunyang Medical College,Shiyan 442000)
Abstract Objective:The cDNA of the carcinoembryonic antigen(CEA) was cloned into pLXSN of the retrovirus plasmid to form eukaryotic expression recombinant plasmid,pLXSN-CEA.Methods:The pLXSN and p91023B-CEA-17 were digested with EcoRI separately,and the linear pLXSN and CEA-cDNA fragment were obtained.And then the CEA-cDNA was inserted into the pLXSN through ligation with ligase.Results:The recombinant plasmid pLXSN-CEA-cDNA was successfully cloned into the retrovirus vector plasmid pLXSN ,with the significant recombinant plasmid pLXSN-CEA obtained through screenig.Conclusion:The human gene CEA-cDNA could efficiently be inserted into retrovirus plasmid to form eukaryotic expresson recombinat plasmid pLXSN-CEA.This provides the basis for constructing animal CEA positive rumor cell model and sudying the prevention and therapy of CEA positive tumors.
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Key words Carcinoembryonic Antigen;Retrovirus,MLV-Related;Genetic Vectors;Genes;cloning,Molecular;Plasmids
自1990年开始，美国有多家实验室进行了有关CEA-重组痘苗病毒的研制及其对CEA阳性肿瘤的免疫防治工作[1，2]，现已进入了Ⅰ期临床试验[3，4]，并取得了可喜的效果。我国人口众多，CEA阳性肿瘤的发病率和致死率均高。因此，本课题组率先在国内开展此项重大课题的研究，现已利用我国过去用于预防天花的痘苗病毒天坛株构建了CEA-重组痘苗病毒(CEA-rV)，并对其免疫原性和安全性进行了验证[5，6]。下一步就是要在动物模型上观察该重组病毒对CEA阳性肿瘤的防治功效。由于动物细胞不表达人癌胚抗原(CEA)[1]，因此，必须构建CEA重组质粒并将其导入动物肿瘤细胞使其有效表达CEA方能实现，本文拟将CEA-cDNA插入到逆转录病毒质粒载体pLXSN中，构建成真核表达重组质粒pLXSN-CEA，为后续实验奠定基础。
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1 材料与方法
1.1 材料来源
逆转录病毒质粒pLXSN：由Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)LTR、SV40 ori，新霉素基因neo及Ampr等部分组成，含有EcoRI和BamHI的单一酶切位点，见图1。由中山医科大学免疫学教研室王斌教授提供。
质粒p91023B-CEA-17：含人CEA-cDNA全序列，由加拿大Kaufman实验惠赠。
1.2 质粒pLXSN和p91023B-CEA-17的酶切及片段回收
采用EcoRI分别酶切，低熔点琼脂糖电泳回收线状载体pLXSN及外源基因CEA-cDNA。参照文献[7]进行。
1.3 线状质粒载体与目的基因(CEA-cDNA)片段的连接
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在反应管内加酶切后线状pLXSN 200 ng，200ng CEA-cDAN，l μl 10×T4 DNA连接酶，1Weiss单位T4 DNA连接酶，然后加灭菌三蒸水至10 μl，12 ℃温育12～16 h。同时设阴阳性对照连接反应。
1.4 感受态细菌JM109的制备及连接产物的转化
参照文献[7]进行。
1.5 重组质粒的筛选鉴定
挑取培养板上各单菌落，摇床培养后抽担质粒DNA，并与原环状载体质粒一同电泳，将泳速相同者用EcoRI和BamHI酶切鉴定。
2 结果
用内切酶EcoRI酶切质粒pLXSN及p91023B-CEA-17，获得线状5.8Kb的载体pLXSN及约3Kb的CEA-cDNA片段。连接反应后的转化平板上可见有散在菌落生成。逐一挑出培养并抽提质粒DNA，将与环状载体质粒电泳同步者先用EcoRI酶切，若重组质粒则可获得5.8 Kb和3 Kb两条电泳带。然后用BamHI酶切，CEA-cDNA正向插入重组质粒可产生6.8Kb和2Kb两条带，而反向插入型重组质粒则产生7.8Kb和1Kb两条带。以此可筛选获得有意义的正向重组质粒pLXSN-CEA(图1，图2)。
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图1 CEA-cDNA重组质粒pLXSN-CEA示意图
A CEA-cDNA正向插入型重组质粒pLXSN-CEA
B CEA-cDNA反向型重组质粒pLXSN-CEA
图2 重组质粒pLXSN-CEA 酶切鉴定结果
1 重组质粒pLXSN-CEA(正)BamHI酶切
2 重组质粒pLXSN-CEA(反)BamHI酶切
3 载体质粒pLXSN BamHI酶切
4 重组质粒pLXSN-CEA(正 )EcoRI酶切
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5 载体质粒pLXSN EcoRI酶切
M DNA Marker λ DNA/HindⅢ
3 讨论
癌胚抗原(CEA)是一种重要的肿瘤相关抗原和国际公认的肿瘤标志物，其基因定位于19号染色体长臂(19q13.1～13.2),编码180KD的高度糖基化的蛋白质,存地于胃肠道等腺细胞的质膜。绝大多数结直肠癌、胃癌和胰腺癌，50%的乳腺癌及70%的非小细胞性肺癌细胞有CEA的高表达，人们称这些肿瘤为CEA阳性或表达型肿瘤[8]。由于CEA的免疫原性很弱[9]，一般不能引起机体产生有效的免疫反应，因此机体的免疫系统无法识别肿瘤细胞表面的癌胚抗原，使肿瘤细胞逃避了免疫系统的杀伤。
免疫学研究表明，将弱免疫原物质与强免疫原物质共同表达，后者可增强前者的免疫原性并有抗原提呈作用，进而透导机体产生特异性的免疫反应[5]。CEA-重组痘苗病毒技术的发展，为达此目的提供了有效的方法。国外目前已成功研制了CEA-重组痘苗病毒，并在动物实验和临床Ⅰ期试验获得可喜的效果，为CEA表达型肿瘤的免疫防治带来了希望。本课题组现已利用我国过去用于预防天花的痘苗病毒疫苗株-天坛761株构建成了CEA-重组痘苗病毒，并对其免疫原性进行了验证。为了在动物模型上观察该重组病毒对实验性CEA阳性肿瘤的免疫防治功效，必须先构建CEA重组质粒并将其导入动物肿瘤细胞建立表达人CEA的动物肿瘤细胞模型。本文即是该系列研究的前期工作。
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逆转录病毒质粒pLXSN是一种常见的真核表达载体，其长末端重复序列LTR除含有病毒的大部分转录控制信号，包括启动子和聚(A)化信号外，还含有指导特异性整合的信号，所以插入的外源基因整合后仍是完整的，可以避免整合基因的重排问题[10]。本实验选择将人CEA-cNDA正向插入到pLXSN载体的EcoRI位点，构建成真核表达重组质粒pLXSN-CEA，为进一步将其导入动物肿瘤细胞建立表达CEA的动物肿瘤细胞模型作好准备。
本实验根据载体pLXSN和CEA-cDNA上酶切位点的特点，将所得重组质粒用限制酶BamHI酶切，CEA-cDNA正向插入型重组质粒酶切后产生约6.8 Kb和2Kb两条电泳带，而反向插入型则产生约7.8 Kb和1 Kb两条带，以此鉴定CEA-cDNA在载体质粒中的插入与否。实验结果表明，本实验成功地构建了CEA-cDNA逆转录病毒重组质粒，而且鉴定筛选出了有意义的CEA-cDNA正向插入型重组质粒pLXSN-CEA 。此为后续进一步建立CEA阳性动物肿瘤细胞模型及对CEA阳性肿瘤的基因免疫防治奠定了基础。
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作者简介：卢方安，男，1966年生，医学硕士，讲师
参考文献
1 Robbins PF,Kantor JA,Salgaller M，et al.Transduction and expression of the human carcinoembryonic antigen gene in a murine colon carcinoma cell line.Cancer Res,1992,51:3657
2 Kantor J,Irvine K,Abrams S，et al.Immunnogenicity and safety of a recombinant vaccinia virus expressing the carcinoembryonic antigen gene in a nonhuman.Cancer Res,1992,52:6917
, http://www.100md.com
3 Tsang KY,Zaremba S,Nieroda CA，et al.Generation of human cyrotoxic T cells specific for human carcionembuyonic antigen epitopes from pations immunized with recombinant vacconia-CEA vaccine.J Natl Cancer inst,1995,87:982
4 Cole DJ,Wilson MC,Baron PL，et al.Phage I study of recombinant CEA vaccinia virus vaccine with post vacination CEA peptide challege.Hum Gene Ther,1996,7:1381
5 杨 洁，杨太成，罗超权等.表达人癌胚抗原(CEA)的重组痘苗病毒的构建。中山医科大学学报，1997，18(1)：41
, 百拇医药
6 杨 洁，赖晃文，罗超权等.人癌胚抗菌素原cDNA-重组痘苗病毒接种动物的研究.中山医科大学学报，1997，18(增刊)：41
7 金冬雁译.分子克隆实验指南.第二版.北京：科学技术出版社，1992
8 Esteban JM,Felder B, Ahn C，et al.Prognostic relevance of carcinoembryonic antigen and estrogen receptor status in breast ceacer patienst.Cancer,1994,74:1575
9 Fuchs C,Krapf F, Kern P，et al.CEA-containing immune complexes in sera of patients with colorectal and breast cancer-analysis of complexed immunoglobulin classes.Cancer Immunol Immunother,1998,26:180
10 侯云德.病毒基因工程的原理与方法.人民卫生出版社，1984
(1998-11-29 收稿), 百拇医药