重组链激酶三种复性方式的比较
作者：李 伟 欧阳藩
单位：中国科学院化工冶金研究所生化工程国家重点实验室 北京100080
关键词：重组链激酶；复性；凝胶过滤
摘 要 通过生物活性测定发现重组链激酶的活性与溶液中的尿素浓度大小无关
摘 要 通过生物活性测定发现重组链激酶的活性与溶液中的尿素浓度大小无关，因此活性测定得以简化。在此基础上，对重组链激酶的三种复性方式进行了比较。实验证明，柱上复性快速，高效(回收率达90%以上)，易放大，适用于链激酶生产。
Comparasion of Three Renaturation
Techniques of Recombinant Strep tokinase
, 百拇医药
Li Wei, Ouyang Fan
(State Key Laboratory of Biochemical Engineering, institute of Chemic al Metallurgy, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China)
Abstract Based on the discovery that the activity of recombina nt streptokinase (rSK) is independent with the solution urea concentration, a simplified method in measuring rSK activity is introduced. Comparing with two commonly protein ren aturation techniques, renaturation on the chromatographic column shows to be mor e superior in speed, recovery and easy to be scaled-up.
, 百拇医药
Key Words recombinant streptokinase, renaturation, size exclusi on chromatography
五十年代末，人们将溶血性链球菌产生的链激酶应用于临床，取得了很好的效果。其作用机理是链激酶(SK)与血纤溶酶原(Pg)形成1∶1的复合物，此复合物自身的纤溶酶原极易在活性中心发生变构修饰，由SK*Pg活化SK*Pn(链激酶*纤溶酶复合物)，并且，SK*Pn又可催化自由的纤溶酶原活化成纤溶酶[1]。
重组链激酶(rSK)一般以E.coli做为宿主，表达后以包含体形式存在于胞内，其分离的主要过程是：破碎细胞，离心获取包含体；包含体变性溶解，去变性剂复性；色谱分离(离子交换/疏水色谱)、凝胶过滤分离得到纯品[2，3]。
上述过程中，包含体的变性/复性为纯化所必需，因为包含体为rSK及少量杂质混合缠绕成的不溶物，必须用高浓度变性剂将其解链，然后去除变性剂，恢复其天然状态，使其能进一步得到纯化，本文的工作是采用三种复性方法，通过比较，试图找到针对rSK蛋白特点的复性最佳途径。
, 百拇医药
1 材料
1.1 材料
表达rSK的E.coli菌体由济南金泰生物工程公司惠赠。
1.2 试剂
BSA蛋白标准品，链激酶标准品购自Sigma公司；Tris,EDTA购自Merck公司；其余试剂为国产。
2 方法
2.1 包含体的制备
按文献[4]改动后进行。10g湿菌，用50mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(TE溶液)洗一遍，离心，以30ml同样缓冲液悬浮菌体，按1mg/1ml的比例加入溶菌酶，室温放置30min。
, 百拇医药
2.1.1 细胞破碎 将上述菌液用超声破碎仪(Vibracell,Sonics&MaterialsInc.)破碎，功率100W,30s×次，镜检看破碎是否完全。
2.1.2 包含体的洗涤 将细胞破碎液离心，5000g×15min，弃上清，沉淀用TE-urea(2mol/L)洗涤二遍，可获得较为纯净的包含体蛋白。
2.2 蛋白质浓度的测定
Bradford法[5]，标准蛋白用BSA。
2.3 SK活性测定
溶圈法，根据文献[3]进行。
2.4 透析
据文献[4]进行。直接透析：缓冲液成份为TES(Tris-HCl50mmol/L，pH=8.0，EDTA1mmol/L，NaCl100mmol/L)；梯度透析：开始时在上述缓冲液中加入6M尿素，每隔4-8h后加入TES，使尿素浓度逐渐下降4mol/L→2mol/L→0mol/L(即全部成TES,不含尿素)，两种透析均在室温(18℃)下，磁力搅拌进行。
, http://www.100md.com
2.5 稀释
取100μl溶解于8mol/L尿素中的包含体蛋白，将其分别滴加入900μlTES及含8mol/L尿素的TES中，高速离心(12000r/min,15min)后，测定蛋白浓度，对照分别为TES及TES+8mol/L尿素。
2.6 脱盐
色谱柱为SephadexG-25Hitrap柱，色谱仪为Biopilot,(Pharmacia公司)，上样及脱盐时流速为2ml/min,用25mlTES(即5个柱体积)，然后用含8mol/L尿素和1mol/LNaCl的TES，25ml清洗柱子，再用脱盐时的TES(NaCl浓度0.1mol/L,不含尿素)平衡，体积仍为25ml,此后可再次上样，开始下一个循环。
3 结果
3.1 变性剂与链激酶的活性问题
, 百拇医药
变性剂对SK的活性影响如图1所示。
1～4：Each well 2μ 1 sk solution with the
concentrations 5.0, 0.5, 0.05 , 0.005mg/ml, no urea
5～8： Each well 2μ 1sk soulution with the concentrations
5.0, 0.5, 0.05, 0.00 5mg/ml, and 8mol/L urea
9～12： Controls
, 百拇医药
Fig 1 Comparison of SK activities
实验证明：rSK的溶圈效果，即其活性跟是否含尿素，含多少尿素无关，只与其浓度有关，并且在5h、10h、24h分别观察其溶圈的速度也完全相同。
3.2 复性结果
3.2.1 透析复性 按材料与方法所述，透析分梯度透析与直接透析两种形式进行，结果如表1。
Tab 1 Results of dialysis renaturation
Sample
concentration
(mg/ml)
, 百拇医药
Sample
volume
(ml)
Concentration
after d ialysis
(mg/ml)
Volume after
dialysis
(mg/ml)
Recovery(%)
Step gradient
12.50
, http://www.100md.com
0.65
5.27
0.80
51.89
dialysis
Direct
12.50
0.80
5.44
0.85
46.24
dialysis
3.2.2 稀释复性 稀释复性是包含体复性中另一常用的方法[7]。以7.58mg/ml的SK溶液(含8mol/L的尿素)，稀释10倍，结果是不含8mol/L尿素稀释的回收率83.3%；含8mol/L尿素稀释的回收率100%。
, http://www.100md.com
3.2.3 脱盐柱复性 分子排阻色谱用于蛋白脱盐和去除低分子物质是一常规操作，由于SK在8mol/L尿素中仍有活性，我们的目的就是去除尿素，以利于进一步纯化，故采用脱盐凝胶柱，其结果如表2。Tab 2 Results of dialysis renaturation
Test
Sample
concentration
(mg/ml)
Sample
volume
(ml)
Concentration
, 百拇医药
a fter gel(mg/ml)
filtration
Volume after
gel(ml)
filtration
Recovery(%)
1
3.79
0.50
0.64
2.71
91.57
, 百拇医药
2
3.79
0.50
0.61
2.80
90.68
3
3.58
0.50
0.85
2.71
60.74
4
, 百拇医药
7.58
0.50
0.89
2.73
64.00
4 讨 论
我们推测，SK的活性对其构象要求并不严格，本质上说链激酶并不是酶，它并没有蛋白酶的活性，其作用是通过与纤溶酶原结合成复合物而间接实现的，只要SK能与纤溶酶原结合，且结合能诱导复合物内的纤溶酶原活性中心构象发生变化就足够了。当然，即使是含有8mol/L的SK，在加入平板后，其尿素浓度也会较快稀释(每孔仅加SK2μl)，否则无法说明为何其溶圈速度与不含尿素者完全一致。但有一点可以肯定，SK的活性大小取决于其在溶液中的浓度。
有文献[6]报导：从Clostridium the rmocellum(嗜热纤维素梭状芽孢杆菌)中克隆的葡聚糖酶D(endoglucanaseD)基因，在E.coli中以包含体形式表达，此蛋白溶于8mol/l尿素中仍保持其天然构象。此酶由嗜热菌产生，有此现象可以理解，链激酶出现此种极端表现(即在8mol/L尿素中仍维持然构象)的可能性似乎不大，SK活性不受尿素干扰的原因尚不清楚。
, 百拇医药
透析复性的回收率较低。文献报导可达80%以上[2]，从结果可以看出，梯度透析(逐渐改变透析袋外的尿素梯度)比直接透析(直接在不含尿素环境中透析)要好，但差别不明显。可能此处的样品浓度较高，造成在透析过程中有较多的蛋白沉淀。另外，SK可能处于非天然状态，大量疏水基团暴露，易于互相缠绕，形成沉淀，高浓度下尤其如此。
稀释复性回收率比透析要高，但稀释使样品浓度大大下降，体积增大。
脱盐柱复性样品1和2的上样浓度为3和4的一半，低浓度的回收率显著高于高浓度。这说明，上样浓度不能太高，太高则会形成沉淀。
包含体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性[8]及凝胶柱复性[9，10]两类。其中的凝胶柱复性均是用Sephacry1S-100或Superdex75等分子筛填料，柱较长(40cm～100cm不等)。用脱盐凝胶SephadexG-25在5cm柱上复性还是首次，这当然与SK的活性易于获得有关。相比透析和稀释两种最常用的复性方法，色谱柱复性回收率高(高达90%以上)、快速、易放大(这一点相比透析尤为突出)，样品稀释倍数小(一般五倍左右，这比稀释优越)。参考文献
, http://www.100md.com
1 王中枢，纤维蛋白溶解的生物化学，北京：科学出版社，1991，78
2 任军，黄阳滨，汤其群，等.基因工程链激酶的中试研究.药物生物技术，1991，3(2)∶65
3 郝宏，李华，崔慧斐，等.基因工程链激酶纯化工艺的研究.药物生物技术，1991，3(2)69
4 Sambrook J. Molecular cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory P ress, 1989, 845
5 Bradford MB. A rapid and sensitive method for the quantitaion of microgram qu antities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Annl Bioc hem, 1976, 72∶248
, http://www.100md.com
6 Chaffitte AF, Guillou Y, Goldberg ME, et al. Inclusion bodies of the thermoph ilic endoglucanase D from Clostridium thermocellum are made of native enzyme tha t resist 8M urea. Eur J Biochem, 1992, 205∶369
7 Fisher BE Renaturation of recombinant proteins produced as inclusion bodies. Biotech Adv, 1994, 12∶89
8 Geng X, Chang X. High performance hydrophilic interaction chromatography as a tool for protein refolding. J Chrom, 1992, 599∶185
9 Wemer MH, Clore GM, Gronenborn AM, et al. Refolding proteins by gel filtratio n chromatography. FEBS Lett, 1994, 345∶125
10 Batas B, Chaudhur JB. Protein refolding at high concentration using s ize-exclusion chromatography. Biotech Bioeng, 1995, 50∶16
收稿日期：1999-03-15, 百拇医药
单位：中国科学院化工冶金研究所生化工程国家重点实验室 北京100080
关键词：重组链激酶；复性；凝胶过滤
摘 要 通过生物活性测定发现重组链激酶的活性与溶液中的尿素浓度大小无关
摘 要 通过生物活性测定发现重组链激酶的活性与溶液中的尿素浓度大小无关，因此活性测定得以简化。在此基础上，对重组链激酶的三种复性方式进行了比较。实验证明，柱上复性快速，高效(回收率达90%以上)，易放大，适用于链激酶生产。
Comparasion of Three Renaturation
Techniques of Recombinant Strep tokinase
, 百拇医药
Li Wei, Ouyang Fan
(State Key Laboratory of Biochemical Engineering, institute of Chemic al Metallurgy, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China)
Abstract Based on the discovery that the activity of recombina nt streptokinase (rSK) is independent with the solution urea concentration, a simplified method in measuring rSK activity is introduced. Comparing with two commonly protein ren aturation techniques, renaturation on the chromatographic column shows to be mor e superior in speed, recovery and easy to be scaled-up.
, 百拇医药
Key Words recombinant streptokinase, renaturation, size exclusi on chromatography
五十年代末，人们将溶血性链球菌产生的链激酶应用于临床，取得了很好的效果。其作用机理是链激酶(SK)与血纤溶酶原(Pg)形成1∶1的复合物，此复合物自身的纤溶酶原极易在活性中心发生变构修饰，由SK*Pg活化SK*Pn(链激酶*纤溶酶复合物)，并且，SK*Pn又可催化自由的纤溶酶原活化成纤溶酶[1]。
重组链激酶(rSK)一般以E.coli做为宿主，表达后以包含体形式存在于胞内，其分离的主要过程是：破碎细胞，离心获取包含体；包含体变性溶解，去变性剂复性；色谱分离(离子交换/疏水色谱)、凝胶过滤分离得到纯品[2，3]。
上述过程中，包含体的变性/复性为纯化所必需，因为包含体为rSK及少量杂质混合缠绕成的不溶物，必须用高浓度变性剂将其解链，然后去除变性剂，恢复其天然状态，使其能进一步得到纯化，本文的工作是采用三种复性方法，通过比较，试图找到针对rSK蛋白特点的复性最佳途径。
, 百拇医药
1 材料
1.1 材料
表达rSK的E.coli菌体由济南金泰生物工程公司惠赠。
1.2 试剂
BSA蛋白标准品，链激酶标准品购自Sigma公司；Tris,EDTA购自Merck公司；其余试剂为国产。
2 方法
2.1 包含体的制备
按文献[4]改动后进行。10g湿菌，用50mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(TE溶液)洗一遍，离心，以30ml同样缓冲液悬浮菌体，按1mg/1ml的比例加入溶菌酶，室温放置30min。
, 百拇医药
2.1.1 细胞破碎 将上述菌液用超声破碎仪(Vibracell,Sonics&MaterialsInc.)破碎，功率100W,30s×次，镜检看破碎是否完全。
2.1.2 包含体的洗涤 将细胞破碎液离心，5000g×15min，弃上清，沉淀用TE-urea(2mol/L)洗涤二遍，可获得较为纯净的包含体蛋白。
2.2 蛋白质浓度的测定
Bradford法[5]，标准蛋白用BSA。
2.3 SK活性测定
溶圈法，根据文献[3]进行。
2.4 透析
据文献[4]进行。直接透析：缓冲液成份为TES(Tris-HCl50mmol/L，pH=8.0，EDTA1mmol/L，NaCl100mmol/L)；梯度透析：开始时在上述缓冲液中加入6M尿素，每隔4-8h后加入TES，使尿素浓度逐渐下降4mol/L→2mol/L→0mol/L(即全部成TES,不含尿素)，两种透析均在室温(18℃)下，磁力搅拌进行。
, http://www.100md.com
2.5 稀释
取100μl溶解于8mol/L尿素中的包含体蛋白，将其分别滴加入900μlTES及含8mol/L尿素的TES中，高速离心(12000r/min,15min)后，测定蛋白浓度，对照分别为TES及TES+8mol/L尿素。
2.6 脱盐
色谱柱为SephadexG-25Hitrap柱，色谱仪为Biopilot,(Pharmacia公司)，上样及脱盐时流速为2ml/min,用25mlTES(即5个柱体积)，然后用含8mol/L尿素和1mol/LNaCl的TES，25ml清洗柱子，再用脱盐时的TES(NaCl浓度0.1mol/L,不含尿素)平衡，体积仍为25ml,此后可再次上样，开始下一个循环。
3 结果
3.1 变性剂与链激酶的活性问题
, 百拇医药
变性剂对SK的活性影响如图1所示。
1～4：Each well 2μ 1 sk solution with the
concentrations 5.0, 0.5, 0.05 , 0.005mg/ml, no urea
5～8： Each well 2μ 1sk soulution with the concentrations
5.0, 0.5, 0.05, 0.00 5mg/ml, and 8mol/L urea
9～12： Controls
, 百拇医药
Fig 1 Comparison of SK activities
实验证明：rSK的溶圈效果，即其活性跟是否含尿素，含多少尿素无关，只与其浓度有关，并且在5h、10h、24h分别观察其溶圈的速度也完全相同。
3.2 复性结果
3.2.1 透析复性 按材料与方法所述，透析分梯度透析与直接透析两种形式进行，结果如表1。
Tab 1 Results of dialysis renaturation
Sample
concentration
(mg/ml)
, 百拇医药
Sample
volume
(ml)
Concentration
after d ialysis
(mg/ml)
Volume after
dialysis
(mg/ml)
Recovery(%)
Step gradient
12.50
, http://www.100md.com
0.65
5.27
0.80
51.89
dialysis
Direct
12.50
0.80
5.44
0.85
46.24
dialysis
3.2.2 稀释复性 稀释复性是包含体复性中另一常用的方法[7]。以7.58mg/ml的SK溶液(含8mol/L的尿素)，稀释10倍，结果是不含8mol/L尿素稀释的回收率83.3%；含8mol/L尿素稀释的回收率100%。
, http://www.100md.com
3.2.3 脱盐柱复性 分子排阻色谱用于蛋白脱盐和去除低分子物质是一常规操作，由于SK在8mol/L尿素中仍有活性，我们的目的就是去除尿素，以利于进一步纯化，故采用脱盐凝胶柱，其结果如表2。Tab 2 Results of dialysis renaturation
Test
Sample
concentration
(mg/ml)
Sample
volume
(ml)
Concentration
, 百拇医药
a fter gel(mg/ml)
filtration
Volume after
gel(ml)
filtration
Recovery(%)
1
3.79
0.50
0.64
2.71
91.57
, 百拇医药
2
3.79
0.50
0.61
2.80
90.68
3
3.58
0.50
0.85
2.71
60.74
4
, 百拇医药
7.58
0.50
0.89
2.73
64.00
4 讨 论
我们推测，SK的活性对其构象要求并不严格，本质上说链激酶并不是酶，它并没有蛋白酶的活性，其作用是通过与纤溶酶原结合成复合物而间接实现的，只要SK能与纤溶酶原结合，且结合能诱导复合物内的纤溶酶原活性中心构象发生变化就足够了。当然，即使是含有8mol/L的SK，在加入平板后，其尿素浓度也会较快稀释(每孔仅加SK2μl)，否则无法说明为何其溶圈速度与不含尿素者完全一致。但有一点可以肯定，SK的活性大小取决于其在溶液中的浓度。
有文献[6]报导：从Clostridium the rmocellum(嗜热纤维素梭状芽孢杆菌)中克隆的葡聚糖酶D(endoglucanaseD)基因，在E.coli中以包含体形式表达，此蛋白溶于8mol/l尿素中仍保持其天然构象。此酶由嗜热菌产生，有此现象可以理解，链激酶出现此种极端表现(即在8mol/L尿素中仍维持然构象)的可能性似乎不大，SK活性不受尿素干扰的原因尚不清楚。
, 百拇医药
透析复性的回收率较低。文献报导可达80%以上[2]，从结果可以看出，梯度透析(逐渐改变透析袋外的尿素梯度)比直接透析(直接在不含尿素环境中透析)要好，但差别不明显。可能此处的样品浓度较高，造成在透析过程中有较多的蛋白沉淀。另外，SK可能处于非天然状态，大量疏水基团暴露，易于互相缠绕，形成沉淀，高浓度下尤其如此。
稀释复性回收率比透析要高，但稀释使样品浓度大大下降，体积增大。
脱盐柱复性样品1和2的上样浓度为3和4的一半，低浓度的回收率显著高于高浓度。这说明，上样浓度不能太高，太高则会形成沉淀。
包含体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性[8]及凝胶柱复性[9，10]两类。其中的凝胶柱复性均是用Sephacry1S-100或Superdex75等分子筛填料，柱较长(40cm～100cm不等)。用脱盐凝胶SephadexG-25在5cm柱上复性还是首次，这当然与SK的活性易于获得有关。相比透析和稀释两种最常用的复性方法，色谱柱复性回收率高(高达90%以上)、快速、易放大(这一点相比透析尤为突出)，样品稀释倍数小(一般五倍左右，这比稀释优越)。参考文献
, http://www.100md.com
1 王中枢，纤维蛋白溶解的生物化学，北京：科学出版社，1991，78
2 任军，黄阳滨，汤其群，等.基因工程链激酶的中试研究.药物生物技术，1991，3(2)∶65
3 郝宏，李华，崔慧斐，等.基因工程链激酶纯化工艺的研究.药物生物技术，1991，3(2)69
4 Sambrook J. Molecular cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory P ress, 1989, 845
5 Bradford MB. A rapid and sensitive method for the quantitaion of microgram qu antities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Annl Bioc hem, 1976, 72∶248
, http://www.100md.com
6 Chaffitte AF, Guillou Y, Goldberg ME, et al. Inclusion bodies of the thermoph ilic endoglucanase D from Clostridium thermocellum are made of native enzyme tha t resist 8M urea. Eur J Biochem, 1992, 205∶369
7 Fisher BE Renaturation of recombinant proteins produced as inclusion bodies. Biotech Adv, 1994, 12∶89
8 Geng X, Chang X. High performance hydrophilic interaction chromatography as a tool for protein refolding. J Chrom, 1992, 599∶185
9 Wemer MH, Clore GM, Gronenborn AM, et al. Refolding proteins by gel filtratio n chromatography. FEBS Lett, 1994, 345∶125
10 Batas B, Chaudhur JB. Protein refolding at high concentration using s ize-exclusion chromatography. Biotech Bioeng, 1995, 50∶16
收稿日期：1999-03-15, 百拇医药