LDL-ACM复合物的药代动力学与组织分布
作者：伊 林 毕文祥 乔文本 孔 峰 胡晓燕 徐松德
单位：山东医科大学生物化学教研室，济南250012
关键词：低密度脂蛋白(LDL)；阿克拉霉素(ACM)；药代动力学；组织分布
摘 要 以125I标记的LDL 摘 要 以125I标记的LDL-ACM复合物为示踪剂，研究了其在小鼠体内的药代动力学及组织分布。结果表明：小鼠单次尾静脉给药后的药代动力学符合二房室模型一级动力学，其药代动力学参数与天然LDL相似；组织分布结果显示，尾静脉单次注入90min后，LDL-ACM复合物在H22荷瘤小鼠体内的分布顺序为肾上腺>肝脏>瘤组织>脾和肾>心和肺。与天然LDL的分布基本一致。
Pharmacokinetic and Biodistribution
, http://www.100md.com
of LDL-ACM Complex in Experimen tal Tumor-Bearing Mices
Yi Lin, Bi Wenxiang,Qiao Wenben,Kong Feng,Hu Xiaoyan,Xu Songde
(Department of Biochemistry,Shandong Medical University,Jinan 250012)
Abstract 125 I labeled LDL-ACM complex as a tracer was studied on its co mplex pharmacokinetic and biodistribution in experimental tumor-bearing mice.Th e result indicated:The pharmacokinetic parameters of 125I-LDL- ACM complex were quite similar to those of 125I-LDL.The bi odistribution of LDL-ACM complex was decreased in order of adrenal,liver,tu mor tissue,kidney(and spleen),heart and langs.The biodistribution of LDL-AC M and mature LDL was not significantly different.
, 百拇医药
Key Words LDL, Aclacinomycin(ACM),Pharmacokinetic,Biodistribution
为了增加抗癌药物的抗肿瘤效果及减少对正常组织细胞的副作用，人们提出靶向治疗。
近年来依据癌瘤细胞恶性增殖对胆固醇需要量大(胆固醇是细胞膜的主要组分)的特点，而血液中胆固醇的主要载体是低密度脂蛋白(LDL)，它60%～80%是经受体途径代谢的；多数癌瘤细胞表面低密度脂蛋白受体(LDLR)活性增强，这是以LDLR介导的癌瘤靶向治疗的依据[1,2]。LDL-阿克拉霉素(Aclacinomycin,ACM)复合物在体内外试验证明具有明显靶向细胞毒作用[3]，但其药代动力学研究国内外未见报导。本课题以125I-LDL-ACM为示踪剂，研究该复合物在正常小鼠体内的药代动力学，观察其在荷瘤小鼠体内的分布，并以天然LDL作对照比较。
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1 材 料
昆明系雄性小鼠，体重为20～25g，购自本校实验动物中心；小鼠肝癌H22细胞株购自山东省医科院；ACM标准品由深圳万乐药业有限公司提供，ACM原料药购自四川抗菌素工业研究所制药厂，批号950728。
2 方 法
2.1 LDL的制备
采用密度梯度离心法[4]，经琼脂糖凝胶电泳纯度鉴定为一条带。蛋白质定量采用Lowry法。125I标记LDL采用Iodogen法[5]，(Na125I购自中科院原子能研究所)，标记率为81%，比活度为350cmp/ng。
2.2 LDL-ACM复合物的制备
, 百拇医药
采用温育交换法[6]，精称ACM原料药40mg，加入含有LDL(36mgaPoB)的缓冲液中，总体积20ml，置恒温振荡器，40℃振荡3h，然后在4℃下避光透析48h，除去游离ACM，所得LDL-ACM复合物经0.22μm微孔滤膜除菌后，4℃保存备用。
2.3 ACM含量测定
采用荧光分析法[7]，以氯仿-甲醇为萃取液，用ACM标准品配制一系列不同浓度的标准液，进行荧光分析(ex430mm,em580nm)测得相对荧光强度F值，绘制标准曲线。同法测LDL-ACM复合物的F值，确定其复合物中ACM的含量。
2.4 125I-LDL-ACM复合物的稳定性试验[8]
首先将LDL-ACM复合物用重量盐水调至Cpr=125μgLDL/ml,CACM=41.25μg/ml,CR=2.5μCi/ml。将该复合物与人全血混合后于37℃下孵育1h，发现95%以上的放射性及药物仍保留在血浆中，再将血浆调至密度为1.21g/ml，离心除去脂蛋白后，放射性及药物浓度均小于初始量的5%。
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2.5 小鼠肝癌H22细胞株荷瘤模型
正常昆明系小鼠，每只右腋窝皮下注射H22瘤株2×106个细胞/0.2ml,7d后处死动物，解剖取出肿瘤，称重，计算平均值，瘤重为0.3275±0.0955g。
2.6 125I-LDL-ACM及125I-LDL在正常小鼠体内的药代动力学研究方法
正常小鼠60只，随机分为AB两组，每组30只，试验前48h给KI(0.1g/L)水。A组尾静脉注射125I-LDL-ACM，B组同法注射125I-LDL，两组剂量每只小鼠均为0.5μCi/25ng*pr，分别在给药后0.083，0.25,0.5,1.0,1.5,2.0,4.0,6.0,12.0及24.0h随机杀死3只，取血，待凝固后离心精取血清100μl，测其cpm，取均值。小鼠血清容量以体重的4%计算。血清中的放射性指数(A)以下列公式计算：
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AB两组分别绘制放射性指数(A)-时间T(h)曲线及血中药物浓度(cpm/ml)-时间(T(h)曲线，计算药代动力学参数。
2.7 125I-LDL-ACM及125I-LDL在荷瘤小鼠各组织中的分布
取按上述方法建立的荷瘤鼠6只，分为AB两组，A组从尾静脉注射125I-LDL-ACM，B组同法注射125I-LDL，给药剂量同上，给药后90min断头取血，测cpm，同时取心，肝，脾，肺，肾，肾上腺及瘤组织，体积约为5mm3，冷PBS冲洗，滤纸吸干、称重，测cpm，取均值，各相应组织的放射性指数(B)，以下列公式计算：
, 百拇医药
3 结 果
3.1 125I-LDL-ACM及125I-LDL在正常小鼠体内药代动力学
经3P87软件拟合，125I-LDL-ACM及125I-LDL血清药物浓度(dpm/ml)-时间T(h)曲线为典型的二房室模型，按二房室一级动力学消除，动力学方程分别为：125I-LDL-ACM：
Ct＝649350e-2.57970t+655868e-0.11786t
125I-LDL：
Ct=593279e-1.31832t+566655e-0.11172t
, 百拇医药
分布相半衰期t/2α分别为0.26869及0.52578，消除相半衰期t/αβ分别为5.88097及6.020448；曲线F面积Auc分别为0.58164E+07及0.55223e+07,清除速率CL分别为0.19084及0.20100。见表1。
Tab 1 Pharmacokinetic parameters of 125I-LDL-ACM and 125I-LDL in mice
Parameter
Unit
125I-LDL-ACM
125I-LDL
A
, 百拇医药
649350
593279
Alpha
h-1
2.57970
1.31832
B
655868
566655
Beta
h-1
0.11786
, 百拇医药
0.11172
V(C)
ml.kg-1
0.85043
0.95695
t1/2 α
h
0.26869
0.52578
t1/2 β
h
, 百拇医药 5.88097
6.20448
k21
h-1
1.35493
0.70117
k10
h-1
0.22440
0.21005
k12
h-1
, 百拇医药
1.11832
0.51882
AUC
cpm*h
0.58164E+0.7
0.55223E+07
3.2 125I-LDL-ACM及125I-LDL在荷瘤小鼠体内的分布
125I-IDL-ACM及125I-LDL在荷瘤小鼠体内的分布情况见表2。Tab 2 The distribution of 125I-LDL-ACM complex and
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125I-LDL- in mice (radioactivity index)
Tissue
125I-LDL-ACM Complex(x)
125I-LDL(x)
Adrenal gland
793
809
Iiver
313
315
, 百拇医药 Tumor
229
239
Spleen
205
231
Kidney
156
148
Heart
<100
<100
Lung
, 百拇医药
<100
<100
表2可见125I-LDL-ACM在各组织中的分布次序为肾上腺>肝>瘤>脾、肾>心、肺，与125I-LDL的分布基本一致。4 讨 论
1)采用温育交换法制备LDL-ACM复合物。该复合物中ACM与LDL的重量比为0.33，平均为202.82个ACM/LDL分子，表明载药量较多，此法条件较温和，用HPLC证实在掺药过程中不影响ACM稳定性，对LDL损伤较小[6]。
药代动力学研究中证实LDL-ACM复合物在体内药代动力学方程为Ct=649350e-2.57970t=655868e-0.11786t，分布相半衰期为16min，消除相半衰期为5.88097h，曲线下面积AUC为0.58164E+07，比游离药物显著增大，可在体内缓慢释放，有利于提高抗癌效果，该复合物在腹水型及实体型荷瘤动物模型的抗癌作用研究中也证实了这一点[9]。LDL-ACM与天然LDL在正常小鼠血清中的清除率基本相同，表明LDL-ACM中的LDL部分仍保持天然活性，不被体内巨噬细胞视为异物而被吞噬，说明它是一个良好的药物载体。
, 百拇医药
2)已知多数癌瘤细胞表面的LDLR数目增多，活性增强，而与其配体结合特性不变，使具有抗癌作用的LDL-药物复合物经LDLR介导被癌瘤细胞识别、摄取、浓聚和释放，在癌瘤部位浓聚，可更有效地发挥药物的抗癌效应，降低对正常组织细胞的毒副作用。还发现游离ACM在S-180荷瘤小鼠中的分布与在正常鼠中相似，原型ACM及有生物活性的GM型代谢产物在肺部分布最多，瘤组织中也有一定量分布，而本实验发现LDL-ACM复合物在荷瘤小鼠中的分布依次为肾上腺>肝>瘤>肾和脾，与游离ACM分布不同，这表明该复合物在荷瘤小鼠体内的分布与组织的LDLR活性密切相关，在LDLR活性较高的肾上腺、H22瘤组织和肝脏中浓聚，且与天然LDL在荷瘤小鼠中的分布一致，表明LDL-ACM复合物仍能被受体识别和结合和内吞，具有一定的受体靶向性，通过受体介导发挥更有效的抗癌效应，降低对机体的毒副作用。
有些药物在体外有较强的细胞毒作用，但由于其脂溶性，难以用于临床，本实验证明LDL有可能成为这类药物的简便可行的载体。LDL-ACM通过受体介导，靶向性强，靶组织内药浓高，具有进一步研究开发价值。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Gal D, Ohashi M, MacDonald PC, et al. Low-density lipoprote in as a potential vehicle for ehemotherapeutic agents and radionuclides in the m anagement of gynecologic neoplasm. Am J Obstet Gynecol,1981,139∶877
2 De Smidt P C, Van Berkel TJC. Prolonged serum half-life of anti-neoplastic drugs by incorporation into the low density lipoprotein. Cancer Res, 1990, 50∶7476
3 隋波，毕文祥，徐松德，等.LDL-ACM复合物对胃癌细胞株(SGC-7901， NKM-45)的细 胞毒作用.山东医科大学学报，1997，35(3)∶184
, 百拇医药
4 蔡海江，范乐明，杨绍，等.血清脂蛋白序列超速离心法.南京医学院学报，1983，1∶42
5 王浩丹，铃木智晴，出村黎子，等.The study on radioiodination of peptide hormo nes using Iodogen. 东京女子医科大学杂志，昭和63，58(2)∶267
6 Vitols S, Soderberg-Reid K, Masquever M, et al. Low density lipoprotein for delivery of a water insoluble alkylating agent to malignant cell. In vitro and in vivo studies of a drug-lipoprotein complex. Br J Cancer,1990, 62∶724
7 Mats J R, Collins V, Peterson P G. Delivery of aclacinomycin A to human g lioma cell in vitro by the low-density lipoprotein pathway. Cancer Res , 1983，43∶4600
, 百拇医药
8 Samadi-Boboli M, Favre G, Blancy E, et al. Preparation of low density lipop rotein-9-methoxyel lipticin complex and its cytotxic effect against L1210 and P388 leuckemic cells in vitro. Eur J Cancer Clin Oncol ,1989, 25∶233
9 Weisgraber K H, Innerarity T L, Mahley R W. Role of the lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fi broblasts. J biol Chem,1978,253∶9053
收稿日期:1998-10-21, 百拇医药
单位：山东医科大学生物化学教研室，济南250012
关键词：低密度脂蛋白(LDL)；阿克拉霉素(ACM)；药代动力学；组织分布
摘 要 以125I标记的LDL 摘 要 以125I标记的LDL-ACM复合物为示踪剂，研究了其在小鼠体内的药代动力学及组织分布。结果表明：小鼠单次尾静脉给药后的药代动力学符合二房室模型一级动力学，其药代动力学参数与天然LDL相似；组织分布结果显示，尾静脉单次注入90min后，LDL-ACM复合物在H22荷瘤小鼠体内的分布顺序为肾上腺>肝脏>瘤组织>脾和肾>心和肺。与天然LDL的分布基本一致。
Pharmacokinetic and Biodistribution
, http://www.100md.com
of LDL-ACM Complex in Experimen tal Tumor-Bearing Mices
Yi Lin, Bi Wenxiang,Qiao Wenben,Kong Feng,Hu Xiaoyan,Xu Songde
(Department of Biochemistry,Shandong Medical University,Jinan 250012)
Abstract 125 I labeled LDL-ACM complex as a tracer was studied on its co mplex pharmacokinetic and biodistribution in experimental tumor-bearing mice.Th e result indicated:The pharmacokinetic parameters of 125I-LDL- ACM complex were quite similar to those of 125I-LDL.The bi odistribution of LDL-ACM complex was decreased in order of adrenal,liver,tu mor tissue,kidney(and spleen),heart and langs.The biodistribution of LDL-AC M and mature LDL was not significantly different.
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Key Words LDL, Aclacinomycin(ACM),Pharmacokinetic,Biodistribution
为了增加抗癌药物的抗肿瘤效果及减少对正常组织细胞的副作用，人们提出靶向治疗。
近年来依据癌瘤细胞恶性增殖对胆固醇需要量大(胆固醇是细胞膜的主要组分)的特点，而血液中胆固醇的主要载体是低密度脂蛋白(LDL)，它60%～80%是经受体途径代谢的；多数癌瘤细胞表面低密度脂蛋白受体(LDLR)活性增强，这是以LDLR介导的癌瘤靶向治疗的依据[1,2]。LDL-阿克拉霉素(Aclacinomycin,ACM)复合物在体内外试验证明具有明显靶向细胞毒作用[3]，但其药代动力学研究国内外未见报导。本课题以125I-LDL-ACM为示踪剂，研究该复合物在正常小鼠体内的药代动力学，观察其在荷瘤小鼠体内的分布，并以天然LDL作对照比较。
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1 材 料
昆明系雄性小鼠，体重为20～25g，购自本校实验动物中心；小鼠肝癌H22细胞株购自山东省医科院；ACM标准品由深圳万乐药业有限公司提供，ACM原料药购自四川抗菌素工业研究所制药厂，批号950728。
2 方 法
2.1 LDL的制备
采用密度梯度离心法[4]，经琼脂糖凝胶电泳纯度鉴定为一条带。蛋白质定量采用Lowry法。125I标记LDL采用Iodogen法[5]，(Na125I购自中科院原子能研究所)，标记率为81%，比活度为350cmp/ng。
2.2 LDL-ACM复合物的制备
, 百拇医药
采用温育交换法[6]，精称ACM原料药40mg，加入含有LDL(36mgaPoB)的缓冲液中，总体积20ml，置恒温振荡器，40℃振荡3h，然后在4℃下避光透析48h，除去游离ACM，所得LDL-ACM复合物经0.22μm微孔滤膜除菌后，4℃保存备用。
2.3 ACM含量测定
采用荧光分析法[7]，以氯仿-甲醇为萃取液，用ACM标准品配制一系列不同浓度的标准液，进行荧光分析(ex430mm,em580nm)测得相对荧光强度F值，绘制标准曲线。同法测LDL-ACM复合物的F值，确定其复合物中ACM的含量。
2.4 125I-LDL-ACM复合物的稳定性试验[8]
首先将LDL-ACM复合物用重量盐水调至Cpr=125μgLDL/ml,CACM=41.25μg/ml,CR=2.5μCi/ml。将该复合物与人全血混合后于37℃下孵育1h，发现95%以上的放射性及药物仍保留在血浆中，再将血浆调至密度为1.21g/ml，离心除去脂蛋白后，放射性及药物浓度均小于初始量的5%。
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2.5 小鼠肝癌H22细胞株荷瘤模型
正常昆明系小鼠，每只右腋窝皮下注射H22瘤株2×106个细胞/0.2ml,7d后处死动物，解剖取出肿瘤，称重，计算平均值，瘤重为0.3275±0.0955g。
2.6 125I-LDL-ACM及125I-LDL在正常小鼠体内的药代动力学研究方法
正常小鼠60只，随机分为AB两组，每组30只，试验前48h给KI(0.1g/L)水。A组尾静脉注射125I-LDL-ACM，B组同法注射125I-LDL，两组剂量每只小鼠均为0.5μCi/25ng*pr，分别在给药后0.083，0.25,0.5,1.0,1.5,2.0,4.0,6.0,12.0及24.0h随机杀死3只，取血，待凝固后离心精取血清100μl，测其cpm，取均值。小鼠血清容量以体重的4%计算。血清中的放射性指数(A)以下列公式计算：
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AB两组分别绘制放射性指数(A)-时间T(h)曲线及血中药物浓度(cpm/ml)-时间(T(h)曲线，计算药代动力学参数。
2.7 125I-LDL-ACM及125I-LDL在荷瘤小鼠各组织中的分布
取按上述方法建立的荷瘤鼠6只，分为AB两组，A组从尾静脉注射125I-LDL-ACM，B组同法注射125I-LDL，给药剂量同上，给药后90min断头取血，测cpm，同时取心，肝，脾，肺，肾，肾上腺及瘤组织，体积约为5mm3，冷PBS冲洗，滤纸吸干、称重，测cpm，取均值，各相应组织的放射性指数(B)，以下列公式计算：
, 百拇医药
3 结 果
3.1 125I-LDL-ACM及125I-LDL在正常小鼠体内药代动力学
经3P87软件拟合，125I-LDL-ACM及125I-LDL血清药物浓度(dpm/ml)-时间T(h)曲线为典型的二房室模型，按二房室一级动力学消除，动力学方程分别为：125I-LDL-ACM：
Ct＝649350e-2.57970t+655868e-0.11786t
125I-LDL：
Ct=593279e-1.31832t+566655e-0.11172t
, 百拇医药
分布相半衰期t/2α分别为0.26869及0.52578，消除相半衰期t/αβ分别为5.88097及6.020448；曲线F面积Auc分别为0.58164E+07及0.55223e+07,清除速率CL分别为0.19084及0.20100。见表1。
Tab 1 Pharmacokinetic parameters of 125I-LDL-ACM and 125I-LDL in mice
Parameter
Unit
125I-LDL-ACM
125I-LDL
A
, 百拇医药
649350
593279
Alpha
h-1
2.57970
1.31832
B
655868
566655
Beta
h-1
0.11786
, 百拇医药
0.11172
V(C)
ml.kg-1
0.85043
0.95695
t1/2 α
h
0.26869
0.52578
t1/2 β
h
, 百拇医药 5.88097
6.20448
k21
h-1
1.35493
0.70117
k10
h-1
0.22440
0.21005
k12
h-1
, 百拇医药
1.11832
0.51882
AUC
cpm*h
0.58164E+0.7
0.55223E+07
3.2 125I-LDL-ACM及125I-LDL在荷瘤小鼠体内的分布
125I-IDL-ACM及125I-LDL在荷瘤小鼠体内的分布情况见表2。Tab 2 The distribution of 125I-LDL-ACM complex and
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125I-LDL- in mice (radioactivity index)
Tissue
125I-LDL-ACM Complex(x)
125I-LDL(x)
Adrenal gland
793
809
Iiver
313
315
, 百拇医药 Tumor
229
239
Spleen
205
231
Kidney
156
148
Heart
<100
<100
Lung
, 百拇医药
<100
<100
表2可见125I-LDL-ACM在各组织中的分布次序为肾上腺>肝>瘤>脾、肾>心、肺，与125I-LDL的分布基本一致。4 讨 论
1)采用温育交换法制备LDL-ACM复合物。该复合物中ACM与LDL的重量比为0.33，平均为202.82个ACM/LDL分子，表明载药量较多，此法条件较温和，用HPLC证实在掺药过程中不影响ACM稳定性，对LDL损伤较小[6]。
药代动力学研究中证实LDL-ACM复合物在体内药代动力学方程为Ct=649350e-2.57970t=655868e-0.11786t，分布相半衰期为16min，消除相半衰期为5.88097h，曲线下面积AUC为0.58164E+07，比游离药物显著增大，可在体内缓慢释放，有利于提高抗癌效果，该复合物在腹水型及实体型荷瘤动物模型的抗癌作用研究中也证实了这一点[9]。LDL-ACM与天然LDL在正常小鼠血清中的清除率基本相同，表明LDL-ACM中的LDL部分仍保持天然活性，不被体内巨噬细胞视为异物而被吞噬，说明它是一个良好的药物载体。
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2)已知多数癌瘤细胞表面的LDLR数目增多，活性增强，而与其配体结合特性不变，使具有抗癌作用的LDL-药物复合物经LDLR介导被癌瘤细胞识别、摄取、浓聚和释放，在癌瘤部位浓聚，可更有效地发挥药物的抗癌效应，降低对正常组织细胞的毒副作用。还发现游离ACM在S-180荷瘤小鼠中的分布与在正常鼠中相似，原型ACM及有生物活性的GM型代谢产物在肺部分布最多，瘤组织中也有一定量分布，而本实验发现LDL-ACM复合物在荷瘤小鼠中的分布依次为肾上腺>肝>瘤>肾和脾，与游离ACM分布不同，这表明该复合物在荷瘤小鼠体内的分布与组织的LDLR活性密切相关，在LDLR活性较高的肾上腺、H22瘤组织和肝脏中浓聚，且与天然LDL在荷瘤小鼠中的分布一致，表明LDL-ACM复合物仍能被受体识别和结合和内吞，具有一定的受体靶向性，通过受体介导发挥更有效的抗癌效应，降低对机体的毒副作用。
有些药物在体外有较强的细胞毒作用，但由于其脂溶性，难以用于临床，本实验证明LDL有可能成为这类药物的简便可行的载体。LDL-ACM通过受体介导，靶向性强，靶组织内药浓高，具有进一步研究开发价值。
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参考文献
1 Gal D, Ohashi M, MacDonald PC, et al. Low-density lipoprote in as a potential vehicle for ehemotherapeutic agents and radionuclides in the m anagement of gynecologic neoplasm. Am J Obstet Gynecol,1981,139∶877
2 De Smidt P C, Van Berkel TJC. Prolonged serum half-life of anti-neoplastic drugs by incorporation into the low density lipoprotein. Cancer Res, 1990, 50∶7476
3 隋波，毕文祥，徐松德，等.LDL-ACM复合物对胃癌细胞株(SGC-7901， NKM-45)的细 胞毒作用.山东医科大学学报，1997，35(3)∶184
, 百拇医药
4 蔡海江，范乐明，杨绍，等.血清脂蛋白序列超速离心法.南京医学院学报，1983，1∶42
5 王浩丹，铃木智晴，出村黎子，等.The study on radioiodination of peptide hormo nes using Iodogen. 东京女子医科大学杂志，昭和63，58(2)∶267
6 Vitols S, Soderberg-Reid K, Masquever M, et al. Low density lipoprotein for delivery of a water insoluble alkylating agent to malignant cell. In vitro and in vivo studies of a drug-lipoprotein complex. Br J Cancer,1990, 62∶724
7 Mats J R, Collins V, Peterson P G. Delivery of aclacinomycin A to human g lioma cell in vitro by the low-density lipoprotein pathway. Cancer Res , 1983，43∶4600
, 百拇医药
8 Samadi-Boboli M, Favre G, Blancy E, et al. Preparation of low density lipop rotein-9-methoxyel lipticin complex and its cytotxic effect against L1210 and P388 leuckemic cells in vitro. Eur J Cancer Clin Oncol ,1989, 25∶233
9 Weisgraber K H, Innerarity T L, Mahley R W. Role of the lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fi broblasts. J biol Chem,1978,253∶9053
收稿日期:1998-10-21, 百拇医药