藻酸双酯钠与细胞因子对巨核细胞生成的调控作用
作者：陈元仲 吕联煌
单位：福建医科大学附属协和医院，福建省血液病研究所(福州 350001)
关键词：血小板；成纤维细胞生长因子；碱性；巨核细胞
藻酸双酯钠与细胞因子对巨核细胞生成的调控作用 摘 要 目的和方法：采用血浆凝块(PC)、无血清琼脂(SFA)培养及[125 I]-bFGF 结合试验等方法研究PSS及TSP等8种细胞因子对巨核细胞生成的作用与机制。结果：在PC系统,PSS刺激CFU-MK形成;在SFA系统,PSS无此作用。PSS加强bFGF或再障血清对CFU-MK 形成的刺激作用,但PSS不增加bFGF与其高亲和力受体的结合。TSP及具有肝素结合位点(HBD)的TSP多肽片段明显抑制CFU-MK的形成,无HBD的TSP片段则无此作用。TSP、PF4及TGFβ1对巨核细胞的抑制作用可被PSS所逆转。结论： PSS对巨核细胞生成起正调控作用,其机制与增强巨核细胞生成刺激因子活性及中和抑制因子的活性有关;TSP是巨核细胞生成负调控因子，HBD是其重要功能基团。
, 百拇医药
Modulating effect of PSS and cytokines on megakaryocytopoiesis in vitro
CHEN Yuan-Zhong， LU Lian-Huang
The Union Hospital of Fujian Medical University, Fujian Institute of Hematology, Fuzhou (350001)
Abstract AIM and METHODS: The effect of propylene glycol alginate sodium sulphate (PSS), eight cytokines including thrombospondin (TSP), PF4, TGFβ1, IL-3,IL-6, EPO, GM-CSF, bFGF and aplastic pig serum (APS) known to be rich in TPO, alone or in combination, on megakaryocytopoiesis and the mechanism of PSS action were studied by plasma clot system (PCS), serum free agar system (SFAS) and [125I]-bFGF binding test. RESULTS: PSS stimulated the growth of CFU -MK in PCS, but not in SFAS and showed no effect on the growth of CFU- GM in PCS and SFAS. PSS, combined with bFGF or APS, resulted in an additive stimulation on the growth of CFU-MK and it did not enhance the binding of bFGF to its high affinity receptor. TSP and TSP fragment comprising residues 1-174(TSP1-174) with heparin-binding domain (HBD), but not the TSP559-669 without HBD obviously inhibited the growth of CFU-MK from unfractionated or fractionated Lin- marrow cells. The inhibitory effect of TSP, PF4 or TGFβ1 on the growth of CFU-MK could be abrogated by PSS. CONCLUSION: (1) PSS is a positive modulator of megakaryocytopoiesis by a mechanism of intensifing megakaryocyte colony-stimulating factors such as bFGF, TPO, etc. and neutralizing the inhibitory factors such as TSP, PF4, TGFβ1, etc. and (2) TSP is a negative modulator of megakaryocytopoiesis and its HBD is an important domain of the action.
, 百拇医药
MeSH Blood platelets; Fibroblast growth factor, basic; Megakaryocytes
巨核细胞生成过程受多种正(刺激)性和负(抑制)性细胞因子的调控,作为血小板α颗粒主要成份的血小板反应蛋白(thrombospondin,TSP)是否能影响巨核细胞生成未见报道。近来研究表明，细胞因子的活性也受一些多糖类物质的调节[1]，有报道低分子量肝素fraxiparin(多糖类)对巨核细胞生成具有正调控作用; 但肝素类物质对凝血系统影响较明显。本文选择一种对凝血作用影响较小的类肝素物质——藻酸双酯钠,结合包括TSP在内的多种巨核细胞正、负调控因子,研究它们对巨核细胞生成的影响。
材料与方法
一、材料：
1.细胞因子：重组的鼠IL-3、6、GM-CSF,重组的人EPO(rhEPO)为美国Genezyme产品;rhbFGF、TGFβ1 为R＆D产品；TSP从新鲜制备的凝血酶刺激的血小板中纯化而来，由Legrand教授(法国INSERM、Unit 353)惠赠，rhTSP多肽片段(TSP1-174,含HBD) 及rhTSP多肽片段(TSP559-669,无HBD)分别由以色列Biotech General Ltd及Jack Lawler博士(美国Havard Medical School)提供；人PF4为法国Sanofi Choay产品。
, 百拇医药
2.藻酸双酯钠(propylene glycol alginate sodium sulphate,PSS) 为青岛三药厂产品。
3.再障猪血清(aplastic pig serum, APS)：采集经全身照射(剂量为8 Gy)后第5 d的猪全血并分离出血清。
二、方法：
1.鼠巨核细胞祖细胞(CFU-MK)及粒-巨噬细胞祖细胞(CFU-GM)培养：
(1) 正常鼠骨髓单个核细胞(MNC)制备：6～8周龄Balb/c鼠经颈椎脱位处死，取其股骨，用5～10 mL α-MEM冲洗髓腔,骨髓细胞经淋巴细胞分层液分离MNC。
(2) 去除成熟细胞组份的鼠骨髓细胞 (Lineage negative，Lin-)制备：在上述MNC中加入抗鼠B细胞单抗(RA3-6B2)、抗鼠粒细胞单抗(RA6-8C)、抗鼠巨噬细胞单抗(M1-70.15)、抗鼠Ly-2单抗(CD8a)及抗鼠L3/T4单抗(CD4)(均为美国Caltag Lab产品)，经孵育、洗涤后,加入包被羊抗鼠IgG的磁珠(挪威Dynal产品),通过磁力方法除去MNC中上述成熟的细胞,未被吸附的细胞，即为Lin-骨髓细胞，详细方法见文献[2，3]。
, 百拇医药
(3) 血浆凝块培养系统(plasma clot system, PCS)：每毫升培养体系含有2×105骨髓MNC(Lin-细胞为8×104/mL)、1%去离子BSA(Sigma)、10%枸椽酸抗凝牛血浆(法国Flow Lab)、1×10-4mol/L 2-巯基乙醇、0.34 mg CaCl2及各种待测因子与PSS, 接种于Petric培养碟(1 mL/碟，Lin-细胞培养接种在24孔板，0.25 mL/孔;每个浓度接种3碟/孔，重复3次，下同)。37℃，5%CO2条件培养7 d，凝块经干燥、固定、染色后计数CFU-MK及CFU-GM数，方法详见文献[3]。
(4) 无血清琼脂培养系统(serum free agar system, SFAS)：每毫升培养体系为含2×105骨髓MNC，0.3%琼脂(Sigma)，1×10-4mol/L 2-巯基乙醇, 30% 血清替代物α-MEM以及不同浓度PSS，接种于Petric培养碟(1 mL/碟)，培养时间、染色等方法同PCS。血清替代物的制备见文献[4]。
, 百拇医药
2.白血病细胞集落检测：采用PCS。在24孔培养板中，每孔接种1×103HEL细胞(巨核细胞系)及50 μg/mL的PSS。方法详见文献[5]。
3. [125Ⅰ]-bFGF结合试验：
(1) [125Ⅰ]标记bFGF：应用氯胺明-T(chloramine- T)方法对rhbFGF进行 [125Ⅰ](Amersham)标记。标记后的 [125Ⅰ]-bFGF经Sephadex G-25(Pharmacia)纯化，放射自显影后在bFGF位置上仅见一条带，标记方法见文献[6]。
(2) HEL细胞[125Ⅰ]-bFGF结合试验：HEL细胞用冷结合缓冲液(含25 mmol/L Hepes 的α-MEM,pH7.5)洗涤后，依次加入PSS(5μg /mL)及[125Ⅰ]-bFGF(4 ng/mL),经孵育,洗涤。每管加入0.5 mL含2 mol/L NaCl 20 mmol/L Hepes溶液(pH7.5)洗脱与低亲和力受体(LAR)结合的[125Ⅰ]-bFGF,收集上清;再在每管加0.5 mL含2 mol/L NaCl、20 mmol/L醋酸钠(pH4.0)溶液洗脱与高亲和力受体(HAR)结合的[125Ⅰ]-bFGF,收集上清。测定此二种洗脱液的counts.min-1值。方法详见文献[7]。
, 百拇医药
结果
(一)细胞因子及PSS对鼠CFU-MK及GFU-GM形成的作用:从表1、2可看出IL-3、6、GM-CSF、bFGF对CFU-MK及CFU-GM均有明显刺激作用, EPO对CFU-MK有刺激作用但对CFU-GM无影响。其中,IL-3对CFU-MK的刺激作用最强。TGFβ1、PF4、TSP及 TSP1-174均明显抑制CFU-MK形成,而以TGFβ1的作用最强,TGFβ1对CFU-GM也有明显抑制作用，但PF4、TSP均无此作用。TSP及TSP1-174对CFU-MK的抑制还存在量效关系,TSP也抑制Lin-细胞CFU-MK形成。而TSP559-669对CFU-MK形成无影响。
表1 各种细胞因子对鼠骨髓MNC的CFU-MK,CFU-GM形成
及对CFU-MK大小的作用
, 百拇医药
Tab 1 Effects of cytokines on the number of CFU-MK and CFU-GM and
the size of CFU-MK from murine unfractionated bone marrow cells
CFU-MK
CFU-GM
Cell No/MK colony
Control
26.0±2.4
12.0± 1.4
3.5± 1.6
, 百拇医药
IL-3(10 ng/mL)
159.0±6.6*
67.0±6.6*
8.7±15.1*
IL-6(20 ng/mL)
77.0±3.3*
27.0±3.1*
3.6±2.1
GM-CSF(10 ng/mL)
63.0±4.7*
, 百拇医药
54.0±11.8*
4.0±2.8
EPO(2 U/mL)
42.0±6.2*
14.0± 5.5
3.4±1.6
bFGF(20 ng/mL)
48.0±4.7*
22.0±4.0*
3.5±1.2
TGFβ1(1 ng/mL)
, http://www.100md.com
4.0±2.1*
4.0±2.1*
3.2±0.7
PF4(5 μg/mL)
16.0±4.0*
11.0±4.0
3.3±0.9
TSP(5 μg/mL)
10.0±4.7*
10.0±4.5
, 百拇医药 3.3±0.9
* P<0.01, vs control；(
，n=3)
表2 TSP及其多肽片段对鼠CFU-MK及CFU-GM形成的作用
Tab 2 Effects of TSP and its related fragments on the growth of CFU-MK
and CFU-GM from murine unfractionated bone marrow Cells
CFU-MK
, http://www.100md.com CFU-GM
Cell No/MK colony
Control
31.0±4.3
40.0±5.5
4.4±0.7
TSP(μg/mL)
1.0
15.0±2.6*
36.0±4.5
3.2±0.2*
, 百拇医药 5.0
8.0±1.2**
36.0±5.0
3.1±0.2*
TSP1-174(μg/mL)
1.0
23.0±3.1
37.0±3.1
3.8±0.5
5.0
16.0±4.0*
, 百拇医药
35.0±6.1
3.2±0.2*
TSP559-669(μg/mL)
1.0
28.0±4.3
38.0±5.4
3.9±0.5
5.0
27.0±3.8
40.0±5.0
4.1±0.5
, http://www.100md.com *P<0.05，**P<0.01，vs control; (,n=3)
在PCS中,PSS刺激CFU-MK的生长,且存在量效关系;在SFAS中,PSS无此作用。PSS对CFU-GM的作用则不明显。PSS可中和TGFβ1、PF4、TSP对CFU-MK的抑制作用,增强bFGF或APS对CFU-MK的刺激作用，结果详见表3、4。
表3 PSS对鼠骨髓MNC的CFU-MK及CFU-GM形成的作用
Tab 3 Effect of PSS on murime CFU-MK,CFU-GM from
unfractionated marrow cells (,n=3)
, 百拇医药
CFU-MK
CFU-GM
CFU-MK
CFU-GM
Plasma clot culture
Serum free agar culture
Control
26.0±2.4
12.0±1.4
7.0±2.6
6.0±1.6
PSS (μg/mL)
, http://www.100md.com
0.1
29.0±5.5
14.0±4.0
8.0±2.9
7.0±2.9
0.5
38.0±4.0*
12.0±2.6
8.0±3.6
8.0±4.0
1.0
46.0±4.2**
, 百拇医药
14.0±3.6
9.0±2.9
7.0±3.3
5.0
42.0±5.5**
15.0±6.1
9.0±4.5
9.0±2.9
*P<0.05，**P<0.01, vs control
表4 PSS与各种细胞因子合用对鼠CFU-MK形成的作用
Tab 4 Effect of PSS and cytokines in combination on
, 百拇医药
murine CFU-MK in plasma colt culture (,n=3)
CFU-MK
PSS (1μg/mL)
46.0±4.2
IL-3(10 ng/mL)
159.0±6.6
IL-3+PSS
179.0±5.5
IL-6(20 ng/mL)
, 百拇医药
77.0±3.3
IL-6+PSS
83.0±7.4
GM-CSF(10 ng/mL)
63.0±4.7
GM-CSF+PSS
70.0±4.5
EPO(2 U/mL)
42.0±8.0
EPO+PSS
48.0±3.5
bFGF(20 ng/mL)
, http://www.100md.com
48.0±4.7
bFGF+ASD
75.0±8.7*
APS(20μl/mL)
52.0±5.5
APS+PSS
73.0±8.1*
TGFβ1(1 ng/mL)
4.0±2.1
TGFβ1+PSS
22.0±5.7*
, 百拇医药
PF4(5 μg/mL)
16.0±4.0
PF4+PSS
23.0±7.1*
TSP(5 μg/mL)
10.0±4.7
TSP+PSS
25.0±6.6*
Control
20.0±2.4
*P<0.01, vs the group without PSS
, http://www.100md.com
(二)PSS对HEL细胞集落形成的作用：加PSS组，HEL 细胞集落数(40±4)明显高于对照组(25±3)，P<0.01。
(三)PSS对[125Ⅰ]-bFGF与HEL细胞LAR及HAR结合的影响:[125Ⅰ]-bFGF与HEL细胞上LAR和HAR结合量(counts.min-1)在对照组分别为4192±379和627±11;在PSS组,与LAR结合量降至2497±39,P<0.01，而与HAR结合量未见增多(659±35,P>0.05)。
讨论
本文的结果表明IL-3、6、GM-CSF、EPO、bFGF等均能促进巨核细胞祖细胞增殖，其中IL-3是最强的刺激因子。巨核细胞生成的负调控因子主要来自血小板,已报道的有TGFβ1、PF4、βTG等，构成其负反馈调控机制。TSP是血小板α-颗粒中的主要成分，也能由内皮细胞等产生，在细胞与细胞及细胞与基质之间相互作用中起重要作用。TSP 是否也能抑制巨核细胞生成则未见报道。本文发现TSP对骨髓MNC及Lin-细胞的巨核细胞集落形成均有明显抑制作用,说明TSP的作用不依赖于被去除的那些成熟细胞，而直接作用于早期巨核细胞。此外，含HBD的TSP片段对CFU-MK形成有抑制作用，而无HBD的TSP片段则无此作用，说明HBD是TSP该作用的重要基团。本文首次报道TSP也是巨核细胞生成的一种负调控因子。
, 百拇医药
硫酸肝素蛋白多糖(HSPGs)在细胞膜及基底膜上分布尤为突出,其功能基团是其中的硫酸肝素链。PSS属酸性多糖硫酸酯的类肝素物质,本文结果表明在PCS中PSS对巨核细胞的集落形成有刺激作用,但在SFAS则无此作用,说明PSS的作用有赖于血浆中的某些成分。通过PSS与各种细胞因子联合应用，发现PSS可增强bFGF对巨核细胞增殖刺激作用。bFGF的受体有两种，分别为特异性HAR及HSPGs所组成的LAR，bFGF需先与LAR结合后，才能与HAR结合产生生物效应[8]。PSS作为类肝素物质，是否可促进bFGF与其相应受体的结合呢? 本文选择HEL为细胞模型，研究PSS对bFGF与HEL细胞bFGF高、低亲和力受体结合的作用。结果发现PSS不影响bFGF与HAR的结合，但明显减少bFGF与LAR的结合，表明外源性PSS可作为LAR与bFGF结合，然后即可直接与HAR结合，也说明PSS增强bFGF的作用并非通过促进bFGF与其特异性高亲和力受体结合这一环节。Nugent等[9]发现硫酸肝素可保护bFGF使其免受酶的降解，因此本文的PSS增强bFGF的效应可能与此有关。血小板生成素(TPO)是一种较强的、相对特异的刺激巨核细胞增殖分化的因子,已知APS中富含TPO,本文发现PSS可增强APS对CFU-MK的作用,提示PSS可增强TPO的活性。此外,上述几种巨核细胞负调控因子如TGFβ1、PF4、TSP的结构上均有HBD，其对巨核细胞生成的抑制作用均可被PSS所抵消,近一步说明HBD是这些因子的重要功能基团。上述结果表明PSS对巨核细胞生成起正调控作用,其作用机制主要是通过增强巨核细胞刺激因子的活性并中和抑制因子的活性。
, 百拇医药
本文结果也提示PSS、TSP可能在血小板疾病中有潜在临床应用价值。
参考文献
1 Han ZC, Wan HY, Bellucci S, et al. Glycosaminoglycans stimulate megakaryocytopoiesis in vitro and in vivo. Exp Hematol, 1993,21:1016.
2 Spangrude GJ, Heimfeld S, Weissman IL. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science, 1988,241:58.
3 Han ZC, Belluccis S, Wan HY, et al. New insight into the regulation of megakargocytopoiesis by haematopoietic and bFGF and TGFβ1. Br J Haematol， 1992,81:1.
, 百拇医药
4 Bruno E, Briddle R, Hoffman R. Effect of recombinant and purified hematopoietic growth factors on human megakaryocyte colony formation. Exp Hematol， 1988,16:371.
5 Han ZC, Maurer AM, Bellucci S,et al. Inhibitory effect of PF4 on the growth of human erythroleukemic cells, proposed mechanism of action of PF4. J Lab Clin Med， 1992,120:645.
6 Johnstone A. Immunochemistry in practice. 2nd ed. Blackwell Scientific Publications Ltd.,1987. P118.
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7 Nugent MA, Edlman ER. Kinetics of bFGF binding to its receptor and heparan sulfate proteoglycan: a mechanism for cooperativity. Biochem，1992,31:8876.
8 Klagsbrun M, Baird A. A dual receptor system is required for bFGF activity. Cell， 1991,67:229.
9 Nugent MA, Edelman ER.Transforming growth factor beta 1 stimulates the production of basic fibroblast growth factor binding proteoglycans in Balb/c3T3 cells. J Biol Chem, 1991,267(29):21 256.
(1998年6月1日收稿，1998年11月23日修回), 百拇医药
单位：福建医科大学附属协和医院，福建省血液病研究所(福州 350001)
关键词：血小板；成纤维细胞生长因子；碱性；巨核细胞
藻酸双酯钠与细胞因子对巨核细胞生成的调控作用 摘 要 目的和方法：采用血浆凝块(PC)、无血清琼脂(SFA)培养及[125 I]-bFGF 结合试验等方法研究PSS及TSP等8种细胞因子对巨核细胞生成的作用与机制。结果：在PC系统,PSS刺激CFU-MK形成;在SFA系统,PSS无此作用。PSS加强bFGF或再障血清对CFU-MK 形成的刺激作用,但PSS不增加bFGF与其高亲和力受体的结合。TSP及具有肝素结合位点(HBD)的TSP多肽片段明显抑制CFU-MK的形成,无HBD的TSP片段则无此作用。TSP、PF4及TGFβ1对巨核细胞的抑制作用可被PSS所逆转。结论： PSS对巨核细胞生成起正调控作用,其机制与增强巨核细胞生成刺激因子活性及中和抑制因子的活性有关;TSP是巨核细胞生成负调控因子，HBD是其重要功能基团。
, 百拇医药
Modulating effect of PSS and cytokines on megakaryocytopoiesis in vitro
CHEN Yuan-Zhong， LU Lian-Huang
The Union Hospital of Fujian Medical University, Fujian Institute of Hematology, Fuzhou (350001)
Abstract AIM and METHODS: The effect of propylene glycol alginate sodium sulphate (PSS), eight cytokines including thrombospondin (TSP), PF4, TGFβ1, IL-3,IL-6, EPO, GM-CSF, bFGF and aplastic pig serum (APS) known to be rich in TPO, alone or in combination, on megakaryocytopoiesis and the mechanism of PSS action were studied by plasma clot system (PCS), serum free agar system (SFAS) and [125I]-bFGF binding test. RESULTS: PSS stimulated the growth of CFU -MK in PCS, but not in SFAS and showed no effect on the growth of CFU- GM in PCS and SFAS. PSS, combined with bFGF or APS, resulted in an additive stimulation on the growth of CFU-MK and it did not enhance the binding of bFGF to its high affinity receptor. TSP and TSP fragment comprising residues 1-174(TSP1-174) with heparin-binding domain (HBD), but not the TSP559-669 without HBD obviously inhibited the growth of CFU-MK from unfractionated or fractionated Lin- marrow cells. The inhibitory effect of TSP, PF4 or TGFβ1 on the growth of CFU-MK could be abrogated by PSS. CONCLUSION: (1) PSS is a positive modulator of megakaryocytopoiesis by a mechanism of intensifing megakaryocyte colony-stimulating factors such as bFGF, TPO, etc. and neutralizing the inhibitory factors such as TSP, PF4, TGFβ1, etc. and (2) TSP is a negative modulator of megakaryocytopoiesis and its HBD is an important domain of the action.
, 百拇医药
MeSH Blood platelets; Fibroblast growth factor, basic; Megakaryocytes
巨核细胞生成过程受多种正(刺激)性和负(抑制)性细胞因子的调控,作为血小板α颗粒主要成份的血小板反应蛋白(thrombospondin,TSP)是否能影响巨核细胞生成未见报道。近来研究表明，细胞因子的活性也受一些多糖类物质的调节[1]，有报道低分子量肝素fraxiparin(多糖类)对巨核细胞生成具有正调控作用; 但肝素类物质对凝血系统影响较明显。本文选择一种对凝血作用影响较小的类肝素物质——藻酸双酯钠,结合包括TSP在内的多种巨核细胞正、负调控因子,研究它们对巨核细胞生成的影响。
材料与方法
一、材料：
1.细胞因子：重组的鼠IL-3、6、GM-CSF,重组的人EPO(rhEPO)为美国Genezyme产品;rhbFGF、TGFβ1 为R＆D产品；TSP从新鲜制备的凝血酶刺激的血小板中纯化而来，由Legrand教授(法国INSERM、Unit 353)惠赠，rhTSP多肽片段(TSP1-174,含HBD) 及rhTSP多肽片段(TSP559-669,无HBD)分别由以色列Biotech General Ltd及Jack Lawler博士(美国Havard Medical School)提供；人PF4为法国Sanofi Choay产品。
, 百拇医药
2.藻酸双酯钠(propylene glycol alginate sodium sulphate,PSS) 为青岛三药厂产品。
3.再障猪血清(aplastic pig serum, APS)：采集经全身照射(剂量为8 Gy)后第5 d的猪全血并分离出血清。
二、方法：
1.鼠巨核细胞祖细胞(CFU-MK)及粒-巨噬细胞祖细胞(CFU-GM)培养：
(1) 正常鼠骨髓单个核细胞(MNC)制备：6～8周龄Balb/c鼠经颈椎脱位处死，取其股骨，用5～10 mL α-MEM冲洗髓腔,骨髓细胞经淋巴细胞分层液分离MNC。
(2) 去除成熟细胞组份的鼠骨髓细胞 (Lineage negative，Lin-)制备：在上述MNC中加入抗鼠B细胞单抗(RA3-6B2)、抗鼠粒细胞单抗(RA6-8C)、抗鼠巨噬细胞单抗(M1-70.15)、抗鼠Ly-2单抗(CD8a)及抗鼠L3/T4单抗(CD4)(均为美国Caltag Lab产品)，经孵育、洗涤后,加入包被羊抗鼠IgG的磁珠(挪威Dynal产品),通过磁力方法除去MNC中上述成熟的细胞,未被吸附的细胞，即为Lin-骨髓细胞，详细方法见文献[2，3]。
, 百拇医药
(3) 血浆凝块培养系统(plasma clot system, PCS)：每毫升培养体系含有2×105骨髓MNC(Lin-细胞为8×104/mL)、1%去离子BSA(Sigma)、10%枸椽酸抗凝牛血浆(法国Flow Lab)、1×10-4mol/L 2-巯基乙醇、0.34 mg CaCl2及各种待测因子与PSS, 接种于Petric培养碟(1 mL/碟，Lin-细胞培养接种在24孔板，0.25 mL/孔;每个浓度接种3碟/孔，重复3次，下同)。37℃，5%CO2条件培养7 d，凝块经干燥、固定、染色后计数CFU-MK及CFU-GM数，方法详见文献[3]。
(4) 无血清琼脂培养系统(serum free agar system, SFAS)：每毫升培养体系为含2×105骨髓MNC，0.3%琼脂(Sigma)，1×10-4mol/L 2-巯基乙醇, 30% 血清替代物α-MEM以及不同浓度PSS，接种于Petric培养碟(1 mL/碟)，培养时间、染色等方法同PCS。血清替代物的制备见文献[4]。
, 百拇医药
2.白血病细胞集落检测：采用PCS。在24孔培养板中，每孔接种1×103HEL细胞(巨核细胞系)及50 μg/mL的PSS。方法详见文献[5]。
3. [125Ⅰ]-bFGF结合试验：
(1) [125Ⅰ]标记bFGF：应用氯胺明-T(chloramine- T)方法对rhbFGF进行 [125Ⅰ](Amersham)标记。标记后的 [125Ⅰ]-bFGF经Sephadex G-25(Pharmacia)纯化，放射自显影后在bFGF位置上仅见一条带，标记方法见文献[6]。
(2) HEL细胞[125Ⅰ]-bFGF结合试验：HEL细胞用冷结合缓冲液(含25 mmol/L Hepes 的α-MEM,pH7.5)洗涤后，依次加入PSS(5μg /mL)及[125Ⅰ]-bFGF(4 ng/mL),经孵育,洗涤。每管加入0.5 mL含2 mol/L NaCl 20 mmol/L Hepes溶液(pH7.5)洗脱与低亲和力受体(LAR)结合的[125Ⅰ]-bFGF,收集上清;再在每管加0.5 mL含2 mol/L NaCl、20 mmol/L醋酸钠(pH4.0)溶液洗脱与高亲和力受体(HAR)结合的[125Ⅰ]-bFGF,收集上清。测定此二种洗脱液的counts.min-1值。方法详见文献[7]。
, 百拇医药
结果
(一)细胞因子及PSS对鼠CFU-MK及GFU-GM形成的作用:从表1、2可看出IL-3、6、GM-CSF、bFGF对CFU-MK及CFU-GM均有明显刺激作用, EPO对CFU-MK有刺激作用但对CFU-GM无影响。其中,IL-3对CFU-MK的刺激作用最强。TGFβ1、PF4、TSP及 TSP1-174均明显抑制CFU-MK形成,而以TGFβ1的作用最强,TGFβ1对CFU-GM也有明显抑制作用，但PF4、TSP均无此作用。TSP及TSP1-174对CFU-MK的抑制还存在量效关系,TSP也抑制Lin-细胞CFU-MK形成。而TSP559-669对CFU-MK形成无影响。
表1 各种细胞因子对鼠骨髓MNC的CFU-MK,CFU-GM形成
及对CFU-MK大小的作用
, 百拇医药
Tab 1 Effects of cytokines on the number of CFU-MK and CFU-GM and
the size of CFU-MK from murine unfractionated bone marrow cells
CFU-MK
CFU-GM
Cell No/MK colony
Control
26.0±2.4
12.0± 1.4
3.5± 1.6
, 百拇医药
IL-3(10 ng/mL)
159.0±6.6*
67.0±6.6*
8.7±15.1*
IL-6(20 ng/mL)
77.0±3.3*
27.0±3.1*
3.6±2.1
GM-CSF(10 ng/mL)
63.0±4.7*
, 百拇医药
54.0±11.8*
4.0±2.8
EPO(2 U/mL)
42.0±6.2*
14.0± 5.5
3.4±1.6
bFGF(20 ng/mL)
48.0±4.7*
22.0±4.0*
3.5±1.2
TGFβ1(1 ng/mL)
, http://www.100md.com
4.0±2.1*
4.0±2.1*
3.2±0.7
PF4(5 μg/mL)
16.0±4.0*
11.0±4.0
3.3±0.9
TSP(5 μg/mL)
10.0±4.7*
10.0±4.5
, 百拇医药 3.3±0.9
* P<0.01, vs control；(
，n=3)表2 TSP及其多肽片段对鼠CFU-MK及CFU-GM形成的作用
Tab 2 Effects of TSP and its related fragments on the growth of CFU-MK
and CFU-GM from murine unfractionated bone marrow Cells
CFU-MK
, http://www.100md.com CFU-GM
Cell No/MK colony
Control
31.0±4.3
40.0±5.5
4.4±0.7
TSP(μg/mL)
1.0
15.0±2.6*
36.0±4.5
3.2±0.2*
, 百拇医药 5.0
8.0±1.2**
36.0±5.0
3.1±0.2*
TSP1-174(μg/mL)
1.0
23.0±3.1
37.0±3.1
3.8±0.5
5.0
16.0±4.0*
, 百拇医药
35.0±6.1
3.2±0.2*
TSP559-669(μg/mL)
1.0
28.0±4.3
38.0±5.4
3.9±0.5
5.0
27.0±3.8
40.0±5.0
4.1±0.5
, http://www.100md.com *P<0.05，**P<0.01，vs control; (
,n=3)在PCS中,PSS刺激CFU-MK的生长,且存在量效关系;在SFAS中,PSS无此作用。PSS对CFU-GM的作用则不明显。PSS可中和TGFβ1、PF4、TSP对CFU-MK的抑制作用,增强bFGF或APS对CFU-MK的刺激作用，结果详见表3、4。
表3 PSS对鼠骨髓MNC的CFU-MK及CFU-GM形成的作用
Tab 3 Effect of PSS on murime CFU-MK,CFU-GM from
unfractionated marrow cells (
,n=3), 百拇医药
CFU-MK
CFU-GM
CFU-MK
CFU-GM
Plasma clot culture
Serum free agar culture
Control
26.0±2.4
12.0±1.4
7.0±2.6
6.0±1.6
PSS (μg/mL)
, http://www.100md.com
0.1
29.0±5.5
14.0±4.0
8.0±2.9
7.0±2.9
0.5
38.0±4.0*
12.0±2.6
8.0±3.6
8.0±4.0
1.0
46.0±4.2**
, 百拇医药
14.0±3.6
9.0±2.9
7.0±3.3
5.0
42.0±5.5**
15.0±6.1
9.0±4.5
9.0±2.9
*P<0.05，**P<0.01, vs control
表4 PSS与各种细胞因子合用对鼠CFU-MK形成的作用
Tab 4 Effect of PSS and cytokines in combination on
, 百拇医药
murine CFU-MK in plasma colt culture (
,n=3)CFU-MK
PSS (1μg/mL)
46.0±4.2
IL-3(10 ng/mL)
159.0±6.6
IL-3+PSS
179.0±5.5
IL-6(20 ng/mL)
, 百拇医药
77.0±3.3
IL-6+PSS
83.0±7.4
GM-CSF(10 ng/mL)
63.0±4.7
GM-CSF+PSS
70.0±4.5
EPO(2 U/mL)
42.0±8.0
EPO+PSS
48.0±3.5
bFGF(20 ng/mL)
, http://www.100md.com
48.0±4.7
bFGF+ASD
75.0±8.7*
APS(20μl/mL)
52.0±5.5
APS+PSS
73.0±8.1*
TGFβ1(1 ng/mL)
4.0±2.1
TGFβ1+PSS
22.0±5.7*
, 百拇医药
PF4(5 μg/mL)
16.0±4.0
PF4+PSS
23.0±7.1*
TSP(5 μg/mL)
10.0±4.7
TSP+PSS
25.0±6.6*
Control
20.0±2.4
*P<0.01, vs the group without PSS
, http://www.100md.com
(二)PSS对HEL细胞集落形成的作用：加PSS组，HEL 细胞集落数(40±4)明显高于对照组(25±3)，P<0.01。
(三)PSS对[125Ⅰ]-bFGF与HEL细胞LAR及HAR结合的影响:[125Ⅰ]-bFGF与HEL细胞上LAR和HAR结合量(counts.min-1)在对照组分别为4192±379和627±11;在PSS组,与LAR结合量降至2497±39,P<0.01，而与HAR结合量未见增多(659±35,P>0.05)。
讨论
本文的结果表明IL-3、6、GM-CSF、EPO、bFGF等均能促进巨核细胞祖细胞增殖，其中IL-3是最强的刺激因子。巨核细胞生成的负调控因子主要来自血小板,已报道的有TGFβ1、PF4、βTG等，构成其负反馈调控机制。TSP是血小板α-颗粒中的主要成分，也能由内皮细胞等产生，在细胞与细胞及细胞与基质之间相互作用中起重要作用。TSP 是否也能抑制巨核细胞生成则未见报道。本文发现TSP对骨髓MNC及Lin-细胞的巨核细胞集落形成均有明显抑制作用,说明TSP的作用不依赖于被去除的那些成熟细胞，而直接作用于早期巨核细胞。此外，含HBD的TSP片段对CFU-MK形成有抑制作用，而无HBD的TSP片段则无此作用，说明HBD是TSP该作用的重要基团。本文首次报道TSP也是巨核细胞生成的一种负调控因子。
, 百拇医药
硫酸肝素蛋白多糖(HSPGs)在细胞膜及基底膜上分布尤为突出,其功能基团是其中的硫酸肝素链。PSS属酸性多糖硫酸酯的类肝素物质,本文结果表明在PCS中PSS对巨核细胞的集落形成有刺激作用,但在SFAS则无此作用,说明PSS的作用有赖于血浆中的某些成分。通过PSS与各种细胞因子联合应用，发现PSS可增强bFGF对巨核细胞增殖刺激作用。bFGF的受体有两种，分别为特异性HAR及HSPGs所组成的LAR，bFGF需先与LAR结合后，才能与HAR结合产生生物效应[8]。PSS作为类肝素物质，是否可促进bFGF与其相应受体的结合呢? 本文选择HEL为细胞模型，研究PSS对bFGF与HEL细胞bFGF高、低亲和力受体结合的作用。结果发现PSS不影响bFGF与HAR的结合，但明显减少bFGF与LAR的结合，表明外源性PSS可作为LAR与bFGF结合，然后即可直接与HAR结合，也说明PSS增强bFGF的作用并非通过促进bFGF与其特异性高亲和力受体结合这一环节。Nugent等[9]发现硫酸肝素可保护bFGF使其免受酶的降解，因此本文的PSS增强bFGF的效应可能与此有关。血小板生成素(TPO)是一种较强的、相对特异的刺激巨核细胞增殖分化的因子,已知APS中富含TPO,本文发现PSS可增强APS对CFU-MK的作用,提示PSS可增强TPO的活性。此外,上述几种巨核细胞负调控因子如TGFβ1、PF4、TSP的结构上均有HBD，其对巨核细胞生成的抑制作用均可被PSS所抵消,近一步说明HBD是这些因子的重要功能基团。上述结果表明PSS对巨核细胞生成起正调控作用,其作用机制主要是通过增强巨核细胞刺激因子的活性并中和抑制因子的活性。
, 百拇医药
本文结果也提示PSS、TSP可能在血小板疾病中有潜在临床应用价值。
参考文献
1 Han ZC, Wan HY, Bellucci S, et al. Glycosaminoglycans stimulate megakaryocytopoiesis in vitro and in vivo. Exp Hematol, 1993,21:1016.
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, 百拇医药
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5 Han ZC, Maurer AM, Bellucci S,et al. Inhibitory effect of PF4 on the growth of human erythroleukemic cells, proposed mechanism of action of PF4. J Lab Clin Med， 1992,120:645.
6 Johnstone A. Immunochemistry in practice. 2nd ed. Blackwell Scientific Publications Ltd.,1987. P118.
, 百拇医药
7 Nugent MA, Edlman ER. Kinetics of bFGF binding to its receptor and heparan sulfate proteoglycan: a mechanism for cooperativity. Biochem，1992,31:8876.
8 Klagsbrun M, Baird A. A dual receptor system is required for bFGF activity. Cell， 1991,67:229.
9 Nugent MA, Edelman ER.Transforming growth factor beta 1 stimulates the production of basic fibroblast growth factor binding proteoglycans in Balb/c3T3 cells. J Biol Chem, 1991,267(29):21 256.
(1998年6月1日收稿，1998年11月23日修回), 百拇医药