高糖加高胰岛素对人血管平滑肌细胞增殖及细胞内游离钙水平的影响
作者：张学亮 舒昌达 何军
单位：重庆医科大学附属第一医院内分泌科(重庆400016)
关键词：增殖；钙；肌；平滑；血管；葡萄糖；胰岛素；维拉帕米
高糖加高胰岛素对人血管平滑肌细胞增殖及细胞内游离 钙水平的影响 摘 要 目的：了解高糖加高胰岛素对人血管平滑肌细胞(HVSMC)增殖的影响及其有关机制。方法：用含与不含维拉帕米(Ver)的高糖、高胰岛素、高糖加高胰岛素DMEM培养液分别培养人脐动脉平滑肌细胞3.5 d；并以正常糖(5.6 mmol/L葡萄糖)DMEM培养液培养为对照。结果：高糖、高胰岛素、高糖加高胰岛素培养液培养的各组HVSMC计数及细胞内游离钙水平均显著高于对照组和含1 μmol Ver的高糖、高胰岛素、高糖加高胰岛素培养液培养的各组(P<0.01)。高糖加高胰岛素培养液培养组HVSMC计数及细胞内游离钙水平显著高于高糖、高胰岛素培养液培养的各组(P<0.01)。 结论：高糖加高胰岛素具有协同促进HVSMC增殖的作用，这主要是通过增加细胞膜上钙通道开放而实现的。
, 百拇医药
Effect of high concentration glucose plus high concentration insulin on proliferation and free
Ca2+ level in human smooth muscle cells
ZHANG Xue-Liang,SHU Chang-Da,HE Jun
Department of Endocrinology,First Affiliated Hospital,Chongqing University of Medical Science,Chongqing(400016)
Abstract AIM：To find out that effect of high concentration glucose(Glu)plus high concentration insulin(Ins) on proliferation and free Ca2+level in human vascular smooth muscle cells(HVSMCs) and its mechanism.METHOD：Smooth muscle cells from human umbilical artery were cultured in Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) with 5.6 mmol/L Glu(control,group 1,n=9),DMEM with 27.8 mmol/L Glu(group 2,n=9)，DMEM with 500 mU/L Ins(group 3,n=9),DMEM with 27.8 mmol/L Glu plus 500mU/L Ins(group 4,n=9),DMEM with 1 μmol/L verapamil (Ver)plus 27.8 mmol/L Glu (group 5,n=9),DMEM with l μmol/L Ver plus 500mU/L Ins(group 6,n=9)DMEM with 1 μmol/L Ver plus 27.8 mmol/L Glu and 500 mU/L Ins(group 7,n＝9)for 3.5 days.RESULTS：The cell count and free Ca2+level of HVSMCs in group 2,3,4 were significantly higher than those of HVSMCs in control and group 5,6,7(P<0.01).The cell count and free Ca2+level of HVSMCs in group 4 were significantly higher than those of HVSMCs in group 2,3(P<0.01).CONCLUSION：High concentration glucose plus high concentration insulin coordinately promote proliferation of HVSMCs,and the effect is realized by increasing open of calcium ion channel in membranes.
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MeSH Proliferation; Calcium；Muscle，smooth，vascular;Glucose;Insulin;Verapamil
糖尿病患者心血管病的发病率显著高于非糖尿病人群。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)增殖并迁移入内膜在动脉粥样硬化形成过程中起着重要作用[1]。以往研究表明，VSMC在含高浓度葡萄糖培养液培养后，细胞内出现钙化小球[2]。高胰岛素环境具有促进VSMC增殖的作用[3]。本研究模拟2型糖尿病伴高胰岛素血症状态下VSMC的生长环境，用含与不含维拉帕米(verapamil,Ver)的高浓度葡萄糖加高浓度胰岛素的Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)培养液分别培养人血管平滑肌细胞 (human vascular smooth muscle cells，HVSMC)。观察细胞计数及细胞内游离钙水平；了解高糖加高胰岛素对HVSMC增殖的影响及其有关机制。
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材料与方法
(一)主要试剂：DMEM(Gibco公司产品)；新生牛血清(FBS，杭州四季青生物工程技术研究所产品)。人胰岛素(美国Eli Lilly公司产品)；Ver(天津中央制药厂产品)；Furo-2/AM(上海生理研究所产品)。
(二)方法：
1.HVSMC培养：按熊静波等[4的人脐动脉平滑肌细胞培养的方法进行，细胞传至第8代时用于实验，实验前细胞经无血清DMEM培养液培养24 h，使细胞均处于静止期。每瓶细胞计数均调整至1×108/L，培养液为含20%FBS的DMEM培养液，每瓶5 mL，各培养瓶中所加试剂(终浓度)见表1，各组样本数为9(n=9)。细胞在CO2孵箱中培养3.5 d。
2.细胞计数：融合细胞层经胰蛋白酶消化后用细胞计数板计数。
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3.VSMC内游离钙测定：用Furo-2/AM测定。按文献方法进行[5]。测定前细胞计数调整至3×108/L。用日立F30101型荧光光度计测定荧光值。根据所测静息荧光值(F)、最大荧光值(Fmax)和最小荧光值(Fmin)按公式计算出细胞内游离钙浓度。[Ca2+]i=Kd(F-fmin)/(fmax-F)。Kd常数为224，[Ca2+]i单位为nmol/L。
(三)统计分析：各组结果以均数±标准差(
±s)表示；用t检验对两组间均数进行比较。
结果
不同DMEM培养液培养的HVSMC计数、细胞内游离钙水平及其比较见表1、图1及图2。
, 百拇医药
从表1、图1及图2可以看出，高糖、高胰岛素及高糖加高胰岛素培养液培养的各组HVSMC计数及细胞内游离钙水平均显著高于对照组(P<0.01)。高糖加高胰岛素培养液培养组HVSMC计数及细胞内游离钙水平均显著高于高糖、高胰岛素培养液培养的各组(P<0.01)。含1 μmol/L Ver的高糖、高胰岛素、高糖加高胰岛素培养液培养的各组HVSMC计数和细胞内游离钙水平均显著低于无Ver的高糖、高胰岛素、高糖加高胰岛素培养液培养的各组(P<0.01)及对照组(P<0.05)。
Fig 1 Cell count of HVSMCs cultured in different DMEM(
±s，n＝9).Reagents put in DMEM of group 1(control) to group 7 are shown in Tab 1.*P<0.01，vs group 1,5,6,7;△P<0.01，vs group 4;▲P<0.05，vs group 1.
, 百拇医药
图1 不同DMEM培养液培养的人血管平滑肌细胞计数 表1 不同DMEM培养液培养的人血管平滑肌细胞计数、游离钙水平及其比较
Tab 1 Cell count and free Ca2+level of HVSMCs cultured in different DMEM(
±s，n=9)
Group
DMEM
Cell count(×108/L)
[Ca2+]i(nmol/L)
, 百拇医药
1(control)
5.6mmol/L Glu
3.83±0.61
156.80±18.29
2
27.8mmol/L Glu
6.44±0.88*△
239.33±31.74*△
3
500 mU/L Ins
7.56±0.88*△
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320.00±34.23*△
4
27.8mmol/L Glu+500mU/L Ins
13.33±1.23*
401.63±40.56*
5
1μmol/L Ver+27.8mmol/L Glu
2.17±0.50▲
120.87±10.04▲
6
, http://www.100md.com
1 μmol/L Ver+500mU/L Ins
2.56±0.73▲
122.63±17.55▲
7
1μmol/L Ver+27.8mmol/L Glu
+500mU/L Ins
2.82±0.23▲
125.13±12.63▲
*P<0.01，vs group 1，5，6，7；△P<0.01，vs group 4;▲P<0.05，vs group 1；DMEM＝Dulbecco's modified eagle medium;Glu＝glucose;HVSMCs＝human vascular smooth muscle cells：Ins＝insulin;Ver＝verapamil
, 百拇医药
Fig 2 Free Ca2+ level of HVSMCs cultured in different DMEM(
±s，n＝9).Reagents put in DMEM of group 1(control) to group 7 are shown in Tab 1.P<0.01,vs group 1,5,6,7;△P<0.01，vs group 4;▲P<0.05，vs group 1
图2 不同DMEM培养液培养的血管平滑肌细胞内游离钙水平 讨论
本文结果提示，高葡萄糖及高胰岛素环境具有促进HVSMC增殖和增高细胞内游离钙水平的作用，高糖加高胰岛素时呈现明显的协同作用。上述作用均可被钙通道阻滞剂Ver所阻止。表明上述作用主要是通过增加细胞膜钙通道开放而实现的。
, http://www.100md.com
葡萄糖进入细胞内是经葡萄糖转运蛋白转运而实现的。VSMC膜上的葡萄糖转运蛋白转运葡萄糖时不需要胰岛素的刺激[6]。当细胞外液处于高糖状态时，进入VSMC内的葡萄糖增加，引起钙通道的开放、细胞内钙离子水平增高；胰岛素与受体结合后，受体β-亚单位即酪氨酸激酶激活，引起一系列的蛋白质磷酸化与脱磷酸化反应，导致钙通道的开放，细胞内钙离子水平增高；从而使细胞内蛋白激酶C激活，DNA合成增加，导致细胞有丝分裂，细胞增殖[3，7，8]。高血糖可使血管内皮受损，VSMC暴露[3]，直接受到血中高糖和高胰岛素的作用；高糖加高胰岛素环境对HVSMC增殖及细胞内游离钙水平的增高具有明显的协同促进作用。这可能是2型糖尿病伴高胰岛素血症患者易发生动脉粥样硬化的原因之一。
(致谢：本文实验得到了重庆医科大学检验系熊静波博士、重庆医大一院中心实验室兰燕飞老师及第三军医大学新桥医院王云剑博士的协助，对此表示衷心的感谢!)
, http://www.100md.com 参考文献
1 Winocour P D,Richardson M,Kinlough-Rathbone Rl.Continued platelet interaction with de-endothelialized aortae associated with slower re-endothelialization and more extensive intinal hyperplasia in spontaneously diabetic BB Wistar rats.Int J Exp Pathol,1993,74:603.
2 沈捷，陈家伟，刘铨之，等.葡萄糖与高脂血清对动脉平滑肌细胞结构的影响.中国糖尿病杂志，1994，2(3)：139.
3 Stout R W.Insulin as a mitogenic factor:role in pathogenesis of cardiovascular disease,Am J Med,1991,90(Suppl 2A):62S.
, http://www.100md.com
4 熊静波，彭永正，康格非，等.人脐动脉平滑肌细胞贴块培养法.重庆医科大学学报，1996，21：311.
5 Gopalakrishnan V,Xu Y,Sulakhe P V, et al.Vasopressin(V1)receptor characteristics in rat aortic smooth muscle cells. Am J Physiol,1991,261:H1927.
6 Bell G I.Molecular defects in diabetes mellitus. Diabetes,1991,40:413.
7 Willamson J,Chang K,Frangos M,et al.Hyperglycemic pseudohypoxia and diabetic complications.Diabetes,1993,42:801.
8 薛沿宁，王会信，周廷冲.信号转导机制.见：孙志贤主编.现代生物化学理论与研究技术.第1版.北京：军事医学科学出版社，1995.317～338.
1996年12月18日收稿，1998年11月2日修回, 百拇医药
单位：重庆医科大学附属第一医院内分泌科(重庆400016)
关键词：增殖；钙；肌；平滑；血管；葡萄糖；胰岛素；维拉帕米
高糖加高胰岛素对人血管平滑肌细胞增殖及细胞内游离 钙水平的影响 摘 要 目的：了解高糖加高胰岛素对人血管平滑肌细胞(HVSMC)增殖的影响及其有关机制。方法：用含与不含维拉帕米(Ver)的高糖、高胰岛素、高糖加高胰岛素DMEM培养液分别培养人脐动脉平滑肌细胞3.5 d；并以正常糖(5.6 mmol/L葡萄糖)DMEM培养液培养为对照。结果：高糖、高胰岛素、高糖加高胰岛素培养液培养的各组HVSMC计数及细胞内游离钙水平均显著高于对照组和含1 μmol Ver的高糖、高胰岛素、高糖加高胰岛素培养液培养的各组(P<0.01)。高糖加高胰岛素培养液培养组HVSMC计数及细胞内游离钙水平显著高于高糖、高胰岛素培养液培养的各组(P<0.01)。 结论：高糖加高胰岛素具有协同促进HVSMC增殖的作用，这主要是通过增加细胞膜上钙通道开放而实现的。
, 百拇医药
Effect of high concentration glucose plus high concentration insulin on proliferation and free
Ca2+ level in human smooth muscle cells
ZHANG Xue-Liang,SHU Chang-Da,HE Jun
Department of Endocrinology,First Affiliated Hospital,Chongqing University of Medical Science,Chongqing(400016)
Abstract AIM：To find out that effect of high concentration glucose(Glu)plus high concentration insulin(Ins) on proliferation and free Ca2+level in human vascular smooth muscle cells(HVSMCs) and its mechanism.METHOD：Smooth muscle cells from human umbilical artery were cultured in Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) with 5.6 mmol/L Glu(control,group 1,n=9),DMEM with 27.8 mmol/L Glu(group 2,n=9)，DMEM with 500 mU/L Ins(group 3,n=9),DMEM with 27.8 mmol/L Glu plus 500mU/L Ins(group 4,n=9),DMEM with 1 μmol/L verapamil (Ver)plus 27.8 mmol/L Glu (group 5,n=9),DMEM with l μmol/L Ver plus 500mU/L Ins(group 6,n=9)DMEM with 1 μmol/L Ver plus 27.8 mmol/L Glu and 500 mU/L Ins(group 7,n＝9)for 3.5 days.RESULTS：The cell count and free Ca2+level of HVSMCs in group 2,3,4 were significantly higher than those of HVSMCs in control and group 5,6,7(P<0.01).The cell count and free Ca2+level of HVSMCs in group 4 were significantly higher than those of HVSMCs in group 2,3(P<0.01).CONCLUSION：High concentration glucose plus high concentration insulin coordinately promote proliferation of HVSMCs,and the effect is realized by increasing open of calcium ion channel in membranes.
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MeSH Proliferation; Calcium；Muscle，smooth，vascular;Glucose;Insulin;Verapamil
糖尿病患者心血管病的发病率显著高于非糖尿病人群。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)增殖并迁移入内膜在动脉粥样硬化形成过程中起着重要作用[1]。以往研究表明，VSMC在含高浓度葡萄糖培养液培养后，细胞内出现钙化小球[2]。高胰岛素环境具有促进VSMC增殖的作用[3]。本研究模拟2型糖尿病伴高胰岛素血症状态下VSMC的生长环境，用含与不含维拉帕米(verapamil,Ver)的高浓度葡萄糖加高浓度胰岛素的Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)培养液分别培养人血管平滑肌细胞 (human vascular smooth muscle cells，HVSMC)。观察细胞计数及细胞内游离钙水平；了解高糖加高胰岛素对HVSMC增殖的影响及其有关机制。
, http://www.100md.com
材料与方法
(一)主要试剂：DMEM(Gibco公司产品)；新生牛血清(FBS，杭州四季青生物工程技术研究所产品)。人胰岛素(美国Eli Lilly公司产品)；Ver(天津中央制药厂产品)；Furo-2/AM(上海生理研究所产品)。
(二)方法：
1.HVSMC培养：按熊静波等[4的人脐动脉平滑肌细胞培养的方法进行，细胞传至第8代时用于实验，实验前细胞经无血清DMEM培养液培养24 h，使细胞均处于静止期。每瓶细胞计数均调整至1×108/L，培养液为含20%FBS的DMEM培养液，每瓶5 mL，各培养瓶中所加试剂(终浓度)见表1，各组样本数为9(n=9)。细胞在CO2孵箱中培养3.5 d。
2.细胞计数：融合细胞层经胰蛋白酶消化后用细胞计数板计数。
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3.VSMC内游离钙测定：用Furo-2/AM测定。按文献方法进行[5]。测定前细胞计数调整至3×108/L。用日立F30101型荧光光度计测定荧光值。根据所测静息荧光值(F)、最大荧光值(Fmax)和最小荧光值(Fmin)按公式计算出细胞内游离钙浓度。[Ca2+]i=Kd(F-fmin)/(fmax-F)。Kd常数为224，[Ca2+]i单位为nmol/L。
(三)统计分析：各组结果以均数±标准差(
±s)表示；用t检验对两组间均数进行比较。结果
不同DMEM培养液培养的HVSMC计数、细胞内游离钙水平及其比较见表1、图1及图2。
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从表1、图1及图2可以看出，高糖、高胰岛素及高糖加高胰岛素培养液培养的各组HVSMC计数及细胞内游离钙水平均显著高于对照组(P<0.01)。高糖加高胰岛素培养液培养组HVSMC计数及细胞内游离钙水平均显著高于高糖、高胰岛素培养液培养的各组(P<0.01)。含1 μmol/L Ver的高糖、高胰岛素、高糖加高胰岛素培养液培养的各组HVSMC计数和细胞内游离钙水平均显著低于无Ver的高糖、高胰岛素、高糖加高胰岛素培养液培养的各组(P<0.01)及对照组(P<0.05)。
Fig 1 Cell count of HVSMCs cultured in different DMEM(
±s，n＝9).Reagents put in DMEM of group 1(control) to group 7 are shown in Tab 1.*P<0.01，vs group 1,5,6,7;△P<0.01，vs group 4;▲P<0.05，vs group 1., 百拇医药
图1 不同DMEM培养液培养的人血管平滑肌细胞计数 表1 不同DMEM培养液培养的人血管平滑肌细胞计数、游离钙水平及其比较
Tab 1 Cell count and free Ca2+level of HVSMCs cultured in different DMEM(
±s，n=9)Group
DMEM
Cell count(×108/L)
[Ca2+]i(nmol/L)
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1(control)
5.6mmol/L Glu
3.83±0.61
156.80±18.29
2
27.8mmol/L Glu
6.44±0.88*△
239.33±31.74*△
3
500 mU/L Ins
7.56±0.88*△
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320.00±34.23*△
4
27.8mmol/L Glu+500mU/L Ins
13.33±1.23*
401.63±40.56*
5
1μmol/L Ver+27.8mmol/L Glu
2.17±0.50▲
120.87±10.04▲
6
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1 μmol/L Ver+500mU/L Ins
2.56±0.73▲
122.63±17.55▲
7
1μmol/L Ver+27.8mmol/L Glu
+500mU/L Ins
2.82±0.23▲
125.13±12.63▲
*P<0.01，vs group 1，5，6，7；△P<0.01，vs group 4;▲P<0.05，vs group 1；DMEM＝Dulbecco's modified eagle medium;Glu＝glucose;HVSMCs＝human vascular smooth muscle cells：Ins＝insulin;Ver＝verapamil
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Fig 2 Free Ca2+ level of HVSMCs cultured in different DMEM(
±s，n＝9).Reagents put in DMEM of group 1(control) to group 7 are shown in Tab 1.P<0.01,vs group 1,5,6,7;△P<0.01，vs group 4;▲P<0.05，vs group 1图2 不同DMEM培养液培养的血管平滑肌细胞内游离钙水平 讨论
本文结果提示，高葡萄糖及高胰岛素环境具有促进HVSMC增殖和增高细胞内游离钙水平的作用，高糖加高胰岛素时呈现明显的协同作用。上述作用均可被钙通道阻滞剂Ver所阻止。表明上述作用主要是通过增加细胞膜钙通道开放而实现的。
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葡萄糖进入细胞内是经葡萄糖转运蛋白转运而实现的。VSMC膜上的葡萄糖转运蛋白转运葡萄糖时不需要胰岛素的刺激[6]。当细胞外液处于高糖状态时，进入VSMC内的葡萄糖增加，引起钙通道的开放、细胞内钙离子水平增高；胰岛素与受体结合后，受体β-亚单位即酪氨酸激酶激活，引起一系列的蛋白质磷酸化与脱磷酸化反应，导致钙通道的开放，细胞内钙离子水平增高；从而使细胞内蛋白激酶C激活，DNA合成增加，导致细胞有丝分裂，细胞增殖[3，7，8]。高血糖可使血管内皮受损，VSMC暴露[3]，直接受到血中高糖和高胰岛素的作用；高糖加高胰岛素环境对HVSMC增殖及细胞内游离钙水平的增高具有明显的协同促进作用。这可能是2型糖尿病伴高胰岛素血症患者易发生动脉粥样硬化的原因之一。
(致谢：本文实验得到了重庆医科大学检验系熊静波博士、重庆医大一院中心实验室兰燕飞老师及第三军医大学新桥医院王云剑博士的协助，对此表示衷心的感谢!)
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1 Winocour P D,Richardson M,Kinlough-Rathbone Rl.Continued platelet interaction with de-endothelialized aortae associated with slower re-endothelialization and more extensive intinal hyperplasia in spontaneously diabetic BB Wistar rats.Int J Exp Pathol,1993,74:603.
2 沈捷，陈家伟，刘铨之，等.葡萄糖与高脂血清对动脉平滑肌细胞结构的影响.中国糖尿病杂志，1994，2(3)：139.
3 Stout R W.Insulin as a mitogenic factor:role in pathogenesis of cardiovascular disease,Am J Med,1991,90(Suppl 2A):62S.
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4 熊静波，彭永正，康格非，等.人脐动脉平滑肌细胞贴块培养法.重庆医科大学学报，1996，21：311.
5 Gopalakrishnan V,Xu Y,Sulakhe P V, et al.Vasopressin(V1)receptor characteristics in rat aortic smooth muscle cells. Am J Physiol,1991,261:H1927.
6 Bell G I.Molecular defects in diabetes mellitus. Diabetes,1991,40:413.
7 Willamson J,Chang K,Frangos M,et al.Hyperglycemic pseudohypoxia and diabetic complications.Diabetes,1993,42:801.
8 薛沿宁，王会信，周廷冲.信号转导机制.见：孙志贤主编.现代生物化学理论与研究技术.第1版.北京：军事医学科学出版社，1995.317～338.
1996年12月18日收稿，1998年11月2日修回, 百拇医药