锰对仔鼠脑组织一氧化氮合酶活性的影响
作者：张本延 朱长才 叶方立 范玉华
单位：张本延(武汉科技大学医学院预防医学教研室 (430080));朱长才(武汉科技大学医学院预防医学教研室 (430080));叶方立(武汉科技大学医学院预防医学教研室 (430080));范玉华(同济医科大学解剖教研室)
关键词：锰；仔鼠；脑；一氧化氮合酶
卫生毒理学杂志000406 摘要 为了研究大鼠孕期染锰后，其子代脑组织一氧化氮合酶活性的变化，对妊娠大鼠腹腔注射氯化锰，剂量为0、7.5、15、30mg/kg，然后对其子代30日龄仔鼠脑组织用组织化学法检测一氧化氮合酶活性，并用图象分析仪定量分析。结果表明：实验各组仔鼠脑组织一氧化氮合酶阳性神经元的截面积、平均吸光度、积分吸光度均明显高于对照组(P<0.01)。大鼠孕期染锰，使其子代脑组织一氧化氮合酶活性增强，促使一氧化氮合成增多，从而引起中枢神经受损。
, 百拇医药
Effect of manganese on activity of nitric oxide synthase of filial rat's brain
ZHANG Ben-Yan ZHU Chang-Cai YE Fang-Li et al.
(Department of Preventive Medicine,Medical College Wuhan
University of Science and Technology,Wuhan 430080)
ABSTRACT To study the effect of manganese on actirity of nitric oxide synthase (NOS) in the filial rat's brain,parental pregnant rats were injected intraabdominally with 7.5mg/kg、15mg/kg、30mg/kg MnCl2 for 8 times,every other day.Then the filal rats were killed after being born for 30days, which NOS of brain tissue was detected with histochemical technology and image analysis equipment.Result showed the sectional area、average absorptivity and integral absorptivity of brain NOS positive neurons in the filial rats of every experimental group increased significantly as compared with control group (p<0.01). It's suggested that the activity of brain NOS in the filial couled rat increase after the pregnant rat exposed to manganese.
, 百拇医药
KEY WORDS Manganese; filial rat; Brain; Nitric Oxide Synthase
锰是一种必需微量元素，但过量的锰在体内蓄积，却对中枢神经系统产生损害，而且对雌性大鼠具有生殖毒性[1]，并对子代神经发育产生影响[2]。一氧化氮在体内由一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)催化合成，它在体内具有双重作用，一方面作为信使分子参与体内各种重要生理功能，另一方面当NOS活性增强，NO合成过多却是人类许多常见疾病的病因或重要促进因素[3]。为了研究锰与NOS之间的关系，对大鼠孕期染锰，以探讨锰对其子代脑组织NOS活性的影响。
1 材料与方法
1.1 动物实验
选用刚成年健康Wistar雌性大鼠体重200～250g(由湖北医学科学院实验动物中心提供)，雌雄按1∶1同笼，次晨阴道涂片检查精子，阳性者为妊娠零天。将妊娠大鼠随机分为4组，每组8～12只，其中3组为染锰组，剂量分别为7.5、15、30mg/kg，自妊娠第1～15天，隔日一次腹腔注射氯化锰(MnCl2.4H2O，AR级，上海金山试剂厂生产)，共8次，每次注射前均称体重，对照组腹腔注射0.85%生理盐水。
, http://www.100md.com
1.2 切片制作
大鼠自然分娩后，取其生长30日龄仔鼠用戊巴比妥钠按30mg/kg腹腔注射麻醉后按文献[4]方法，用含1g/L肝素的生理盐水100ml经左心室灌注冲洗，4%多聚甲醛、0.01mol/L PBS(pH7.2)100ml灌注固定；开颅取出脑组织放入上述固定液中后固定2～4小时；再放入20%蔗糖、0.01mol/L PBS(pH7.2)中于4℃冰箱内过夜至组织块下沉；取冠状位作冰冻切片，厚40μm，贴于铬明矾胶玻片，冷气吹干。
1.3 依赖还原型辅酶Ⅱ黄递酶(NADPH-d)组织化学染色
已证实NADPH-d与NOS是同一物质，NADPH-d组织化学染色可作为NOS在体内的分布与活性的一种标志。操作步骤：切片以0.1mol/L PBS浸洗后放入孵育液内，置37℃恒箱温内孵育30min。孵育液组成：1.2mmol/L NADPH(德国B.M公司产品)、0.5mmol/L NBT、0.3%Triton X-100，用0.1mol/L PBS(pH8.0)配制而成。切片取出后放入0.1mol/L PBS(pH7.4)中终止反应。常规脱水、透明、封片，光镜观察。设阴性对照：孵育液不含NAD PH，孵育液不含NBT。
, 百拇医药
1.4 图象分析
采用TJTY-300型全自动图象分析仪，测定各组NOS染色阳性神经元细胞的截面积、平均吸光度、积分吸光度。
2 结果
2.1
NOS阳性神经元呈蓝色，胞浆中含有蓝色微小颗粒，有的近胞体处的突触中也有蓝色颗粒，胞浆染色程度相互间存在差异，胞核部位无染色颗粒，呈空白状(图1)。NOS阳性神经元主要分布于中脑导水管周围灰质、被盖部核团、中缝核团等处，与文献报道一致[5]。观察各组中脑导水管周围灰质NOS阳性神经元，对照组胞浆染色较浅，胞体较小，分散疏松；随着染锰剂量增加，胞浆染色加深，胞体增大，数量增多，有的浓密聚集成团，胞浆呈深蓝黑色，光镜下几乎不透明，胞核空白区缩小甚至完全消失(图2、3、4、5)。所有阴性对照试验均呈阴性。
, 百拇医药
图1 NOS阳性神经元 120X
图2 对照组NOS阳性神经元 30X
图3 7.5mg/kg组NOS阳性神经元 30X
2.2 图象分析 结果见附表。
附表 大鼠孕期染锰对30日龄仔鼠脑组织NOS阳性神经元的影响(
±s)
, 百拇医药
剂量(mg/kg)
细胞数
平均截面积(μm2)
平均吸光度
积分吸光度
0
130
70.62±22.67
0.3157±0.0855
22.03±9.04
7.5
160
, 百拇医药
79.71±24.03**
0.3723±0.0634**
30.55±12.15**
15
161
90.56±20.83**
0.4694±0.0392**
42.33±10.61**
30
164
, 百拇医药
98.61±25.70**
0.4952±0.0566**
49.31±14.15**
与对照组比较* *P<0.01
图4 15mg/kg组NOS阳性神经元 30X
图5 30mg/kg组NOS阳性神经元 30X
, 百拇医药
3 讨论
方智慧报道，出生后30日大鼠NOS阳性神经元与出生后70日大鼠比较无明显区别，表明神经系统在出生后30日已接近或达到成年鼠状态[5]。此次观察到实验各组NOS阳性神经元明显增多，染色加深，显然与锰的作用有关。锰是一种神经毒物，主要损害中枢神经系统。大鼠孕期接触锰，通过胎盘屏障使其子代脑组织中锰含量显著增加，且主要集中在中脑[6]。蓄积的锰不断释放，可通过各种途径影响中枢神经系统的发育，如可抑制黑质中酪氨酸羟化酶神经元的发育，导致胺能神经递质减少。锰还是多种酶的激活剂[7]，它能激活细胞色素酶P450活性、产生大量自由基，干扰能量代谢，继之引起氨基酸的兴奋性毒性，导致神经细胞变性、坏死。Knowless等[8]证实，NOS的C端与细胞色素酶P450有极大同源性，实际上在肝微粒体，细胞色素酶P450能催化合成NOS。
本次研究显示，亲代孕期接触锰，可使子代脑组织中锰蓄积，诱导NOS合成。NOS能催化合成NO，过量的NO是一种细胞毒分子，它也介导了兴奋性氨基酸神经毒性[9]，并且NO通过干扰能量代谢、抑制ATP合成等途径，造成组织和细胞的变性、坏死。所以，NOS的诱导合成就成为许多疾病的发病关键。本次研究揭示，锰对发育中的中枢神经损害的各种途径中，有一种可能是锰诱导NOS活性增强，引起内源性NO大量增加，通过NO的细胞毒作用产生危害，这为锰的神经毒作用机理的研究及导致内源性NO增加的原因提供了一个新的依据。
, http://www.100md.com
(图象分析由同济医科大学病理教研室倪娟老师进行，特此致谢；参加本实验还有本校98届毕业生肖冰水、徐滕等。)
冶金部自然科学基金资助课题
参考文献
1，刘佳娟，杨柏宁，柯铭华，等.锰对雌性大鼠繁殖的影响.广西预防医学，1995，1(6)：346.
2，师娟子，武映东，郭仁舆.哺乳期母鼠饮高锰溶液对仔鼠纹状体的影响.中华劳动卫生与职业病杂志，1996，14(1)：46.
3，钟慈声，孙安阳.一氧化氮的生物医学上海：上海医科大学出版社，1997，106～107
4，李光千，王健本，彭宣林.大鼠肺一氧化氮合酶阳性神经结构解剖学杂志，1996；19(1)：21
, 百拇医药
5，方智慧，黄大鹏，王金兰，等.大鼠脑干一氧化氮合酶阳性神经元的分布与发育.解剖学杂志，1998，21(1)：11
6，杨伯宁，张德兴，檀进发，等.孕期锰染毒对仔鼠脑内锰、锌、铜、铁的影响.卫生毒理学杂志，1997，11(2)：101
7，Dawson R JR, Beal MF, Bondy SC，et al. Excitotoxins,aging,and enviyonmental.neur otoxins:implications for understanding human neurodegenerative disease.Toxicol Appl Pharmacol,1995,134:1.
8，Knowles RG,Moncada S. Ntric oxide synthases in mammals.Biochem J, 1994;298(2):249.
9，Kollegger H, Mchean GJ, Tipton KF. Reduction of striatal N-methyl-D-aspartate toxicity by inhibition of nitric oxide synthase.Biochem Pharmacol,1993;45(1)：260.
(收稿：1998-07-18), 百拇医药
单位：张本延(武汉科技大学医学院预防医学教研室 (430080));朱长才(武汉科技大学医学院预防医学教研室 (430080));叶方立(武汉科技大学医学院预防医学教研室 (430080));范玉华(同济医科大学解剖教研室)
关键词：锰；仔鼠；脑；一氧化氮合酶
卫生毒理学杂志000406 摘要 为了研究大鼠孕期染锰后，其子代脑组织一氧化氮合酶活性的变化，对妊娠大鼠腹腔注射氯化锰，剂量为0、7.5、15、30mg/kg，然后对其子代30日龄仔鼠脑组织用组织化学法检测一氧化氮合酶活性，并用图象分析仪定量分析。结果表明：实验各组仔鼠脑组织一氧化氮合酶阳性神经元的截面积、平均吸光度、积分吸光度均明显高于对照组(P<0.01)。大鼠孕期染锰，使其子代脑组织一氧化氮合酶活性增强，促使一氧化氮合成增多，从而引起中枢神经受损。
, 百拇医药
Effect of manganese on activity of nitric oxide synthase of filial rat's brain
ZHANG Ben-Yan ZHU Chang-Cai YE Fang-Li et al.
(Department of Preventive Medicine,Medical College Wuhan
University of Science and Technology,Wuhan 430080)
ABSTRACT To study the effect of manganese on actirity of nitric oxide synthase (NOS) in the filial rat's brain,parental pregnant rats were injected intraabdominally with 7.5mg/kg、15mg/kg、30mg/kg MnCl2 for 8 times,every other day.Then the filal rats were killed after being born for 30days, which NOS of brain tissue was detected with histochemical technology and image analysis equipment.Result showed the sectional area、average absorptivity and integral absorptivity of brain NOS positive neurons in the filial rats of every experimental group increased significantly as compared with control group (p<0.01). It's suggested that the activity of brain NOS in the filial couled rat increase after the pregnant rat exposed to manganese.
, 百拇医药
KEY WORDS Manganese; filial rat; Brain; Nitric Oxide Synthase
锰是一种必需微量元素，但过量的锰在体内蓄积，却对中枢神经系统产生损害，而且对雌性大鼠具有生殖毒性[1]，并对子代神经发育产生影响[2]。一氧化氮在体内由一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)催化合成，它在体内具有双重作用，一方面作为信使分子参与体内各种重要生理功能，另一方面当NOS活性增强，NO合成过多却是人类许多常见疾病的病因或重要促进因素[3]。为了研究锰与NOS之间的关系，对大鼠孕期染锰，以探讨锰对其子代脑组织NOS活性的影响。
1 材料与方法
1.1 动物实验
选用刚成年健康Wistar雌性大鼠体重200～250g(由湖北医学科学院实验动物中心提供)，雌雄按1∶1同笼，次晨阴道涂片检查精子，阳性者为妊娠零天。将妊娠大鼠随机分为4组，每组8～12只，其中3组为染锰组，剂量分别为7.5、15、30mg/kg，自妊娠第1～15天，隔日一次腹腔注射氯化锰(MnCl2.4H2O，AR级，上海金山试剂厂生产)，共8次，每次注射前均称体重，对照组腹腔注射0.85%生理盐水。
, http://www.100md.com
1.2 切片制作
大鼠自然分娩后，取其生长30日龄仔鼠用戊巴比妥钠按30mg/kg腹腔注射麻醉后按文献[4]方法，用含1g/L肝素的生理盐水100ml经左心室灌注冲洗，4%多聚甲醛、0.01mol/L PBS(pH7.2)100ml灌注固定；开颅取出脑组织放入上述固定液中后固定2～4小时；再放入20%蔗糖、0.01mol/L PBS(pH7.2)中于4℃冰箱内过夜至组织块下沉；取冠状位作冰冻切片，厚40μm，贴于铬明矾胶玻片，冷气吹干。
1.3 依赖还原型辅酶Ⅱ黄递酶(NADPH-d)组织化学染色
已证实NADPH-d与NOS是同一物质，NADPH-d组织化学染色可作为NOS在体内的分布与活性的一种标志。操作步骤：切片以0.1mol/L PBS浸洗后放入孵育液内，置37℃恒箱温内孵育30min。孵育液组成：1.2mmol/L NADPH(德国B.M公司产品)、0.5mmol/L NBT、0.3%Triton X-100，用0.1mol/L PBS(pH8.0)配制而成。切片取出后放入0.1mol/L PBS(pH7.4)中终止反应。常规脱水、透明、封片，光镜观察。设阴性对照：孵育液不含NAD PH，孵育液不含NBT。
, 百拇医药
1.4 图象分析
采用TJTY-300型全自动图象分析仪，测定各组NOS染色阳性神经元细胞的截面积、平均吸光度、积分吸光度。
2 结果
2.1
NOS阳性神经元呈蓝色，胞浆中含有蓝色微小颗粒，有的近胞体处的突触中也有蓝色颗粒，胞浆染色程度相互间存在差异，胞核部位无染色颗粒，呈空白状(图1)。NOS阳性神经元主要分布于中脑导水管周围灰质、被盖部核团、中缝核团等处，与文献报道一致[5]。观察各组中脑导水管周围灰质NOS阳性神经元，对照组胞浆染色较浅，胞体较小，分散疏松；随着染锰剂量增加，胞浆染色加深，胞体增大，数量增多，有的浓密聚集成团，胞浆呈深蓝黑色，光镜下几乎不透明，胞核空白区缩小甚至完全消失(图2、3、4、5)。所有阴性对照试验均呈阴性。
, 百拇医药
图1 NOS阳性神经元 120X
图2 对照组NOS阳性神经元 30X
图3 7.5mg/kg组NOS阳性神经元 30X
2.2 图象分析 结果见附表。
附表 大鼠孕期染锰对30日龄仔鼠脑组织NOS阳性神经元的影响(
±s), 百拇医药
剂量(mg/kg)
细胞数
平均截面积(μm2)
平均吸光度
积分吸光度
0
130
70.62±22.67
0.3157±0.0855
22.03±9.04
7.5
160
, 百拇医药
79.71±24.03**
0.3723±0.0634**
30.55±12.15**
15
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90.56±20.83**
0.4694±0.0392**
42.33±10.61**
30
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98.61±25.70**
0.4952±0.0566**
49.31±14.15**
与对照组比较* *P<0.01
图4 15mg/kg组NOS阳性神经元 30X
图5 30mg/kg组NOS阳性神经元 30X
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3 讨论
方智慧报道，出生后30日大鼠NOS阳性神经元与出生后70日大鼠比较无明显区别，表明神经系统在出生后30日已接近或达到成年鼠状态[5]。此次观察到实验各组NOS阳性神经元明显增多，染色加深，显然与锰的作用有关。锰是一种神经毒物，主要损害中枢神经系统。大鼠孕期接触锰，通过胎盘屏障使其子代脑组织中锰含量显著增加，且主要集中在中脑[6]。蓄积的锰不断释放，可通过各种途径影响中枢神经系统的发育，如可抑制黑质中酪氨酸羟化酶神经元的发育，导致胺能神经递质减少。锰还是多种酶的激活剂[7]，它能激活细胞色素酶P450活性、产生大量自由基，干扰能量代谢，继之引起氨基酸的兴奋性毒性，导致神经细胞变性、坏死。Knowless等[8]证实，NOS的C端与细胞色素酶P450有极大同源性，实际上在肝微粒体，细胞色素酶P450能催化合成NOS。
本次研究显示，亲代孕期接触锰，可使子代脑组织中锰蓄积，诱导NOS合成。NOS能催化合成NO，过量的NO是一种细胞毒分子，它也介导了兴奋性氨基酸神经毒性[9]，并且NO通过干扰能量代谢、抑制ATP合成等途径，造成组织和细胞的变性、坏死。所以，NOS的诱导合成就成为许多疾病的发病关键。本次研究揭示，锰对发育中的中枢神经损害的各种途径中，有一种可能是锰诱导NOS活性增强，引起内源性NO大量增加，通过NO的细胞毒作用产生危害，这为锰的神经毒作用机理的研究及导致内源性NO增加的原因提供了一个新的依据。
, http://www.100md.com
(图象分析由同济医科大学病理教研室倪娟老师进行，特此致谢；参加本实验还有本校98届毕业生肖冰水、徐滕等。)
冶金部自然科学基金资助课题
参考文献
1，刘佳娟，杨柏宁，柯铭华，等.锰对雌性大鼠繁殖的影响.广西预防医学，1995，1(6)：346.
2，师娟子，武映东，郭仁舆.哺乳期母鼠饮高锰溶液对仔鼠纹状体的影响.中华劳动卫生与职业病杂志，1996，14(1)：46.
3，钟慈声，孙安阳.一氧化氮的生物医学上海：上海医科大学出版社，1997，106～107
4，李光千，王健本，彭宣林.大鼠肺一氧化氮合酶阳性神经结构解剖学杂志，1996；19(1)：21
, 百拇医药
5，方智慧，黄大鹏，王金兰，等.大鼠脑干一氧化氮合酶阳性神经元的分布与发育.解剖学杂志，1998，21(1)：11
6，杨伯宁，张德兴，檀进发，等.孕期锰染毒对仔鼠脑内锰、锌、铜、铁的影响.卫生毒理学杂志，1997，11(2)：101
7，Dawson R JR, Beal MF, Bondy SC，et al. Excitotoxins,aging,and enviyonmental.neur otoxins:implications for understanding human neurodegenerative disease.Toxicol Appl Pharmacol,1995,134:1.
8，Knowles RG,Moncada S. Ntric oxide synthases in mammals.Biochem J, 1994;298(2):249.
9，Kollegger H, Mchean GJ, Tipton KF. Reduction of striatal N-methyl-D-aspartate toxicity by inhibition of nitric oxide synthase.Biochem Pharmacol,1993;45(1)：260.
(收稿：1998-07-18), 百拇医药