钙拮抗剂尼卡地平的HPLC法分析及其在兔体内药代动力学研究
作者：王嗣岑 贺浪冲
单位：王嗣岑 贺浪冲(西安医科大学药学院 710061)
关键词：尼卡地平；钙拮抗剂；药动学；高效液相色谱
药物分析杂志000306 摘要 目的：建立兔血浆中钙拮抗剂尼卡地平的反相高效液相色谱分析方法，并对其在兔体内的药代动力学进行研究。方法：血浆样品在弱碱性条件下经环己烷-异丙醇(96∶4)提取，用LiChrosorb C18反相柱，甲醇-水(75∶25)为流动相，流速1.0 mL.min-1，检测波长236 nm等条件下，分析测定。结果：方法平均回收率为98.27%～100.4%，RSD<5.0%，线性范围：11～110 ng(r=0.998 1)，最低检测限为10 ng。结论：本法操作简便、准确灵敏、重现性好，可用于尼卡地平的药动学研究。
, 百拇医药
Determination and Pharmacokinetic Study of Nicardipine
in Rabbit by High Performance Liquid Chromatography
Wang Sicen，He Langchong
(College of Pharmacy Xi′an Medical University，Xi′an 710061)
Abstract Objective：To establish HPLC method for determination and pharmacokinetic study of nicardipine in rabbit.Methods:The blood samples were diluted by 0.05 mol.L-1 Na2HPO4 buffer solution(pH=7.4) and extracted with cyclohexane-2-propanol(96∶4).The LiChrosorb C18 column(150 mm×4.6 mm，5 μm)was used as analytical column.The mobile phase consisted of methanol-water(75∶25).The flow rate was 1.0 mL.min-1 with UV detection at 236 nm.Results:The recovery of the method was 98.27%～100.4%，RSD<5.0%.The linear range was 11～110 ng(r=0.998 1) and determination limit was 10 ng.Conclusion:The method had a good selectivity、sensitivity and reproducibility and can be used for pharmacokinetic studies of nicardipine in rabbit plasma.
, 百拇医药
Key words nicardipine,calcium antagonists,pharmacokinetics,HPLC
尼卡地平(Nicardipine,NCD)属1，4-二氢吡啶类钙拮抗剂，为血管扩张型降压药。通过抑制细胞外Ca2+的内流、松弛血管平滑肌而起到降压作用，主要用于低、中度高血压病[1]。文献报道有紫外法[2]、高效液相色谱法[3]等方法测定血浆中的NCD。在文献的基础上本文对NCD的提取方法及高效液相色谱条件进行了研究，建立了一种反相高效液相色谱(RP-HPLC)方法，用于对兔血浆中NCD的浓度进行分析测定，并对其在兔体内的药代动力学进行研究。
1 试剂与仪器
NCD对照品(美国Sigma公司)，NCD原料药(西北第二合成药厂)。环己烷、异丙醇为分析纯；甲醇为色谱纯；水为三重蒸馏水。其余试剂均为分析纯。
, 百拇医药
Shimadzu 10Avp高效液相色谱仪，配置SPD-10A vp型可调波长检测器，LC10-A vp型溶剂输送泵，HP3395A数据处理机；Herlme ZK401高速冷冻离心机；SK-1型快速混匀器。
2 实验方法
2.1 色谱条件 色谱柱LiChrosorb C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相为甲醇-水(75∶25)，使用前用0.45 μm滤膜减压过滤，超声除气；检测波长236 nm；流速1 mL.min-1。
2.2 NCD对照品溶液的配制 精密称取NCD对照品适量，加甲醇溶解并定容至10 mL，即得浓度为0.22 mg.mL-1的对照品溶液。
2.3 样品采集 取健康家兔5只，雌雄不限，体重(1.9±0.3)kg，由西安医科大学实验动物中心提供。另取NCD原料药研磨成细粉，混悬于生理盐水中，按每公斤体重40 mg的剂量灌胃给药。于灌胃前及灌胃后0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，10，24 h耳动脉采血2 mL，肝素抗凝，3 000 r.min-1离心制成血浆。
, http://www.100md.com
2.4 样品预处理 取血浆1.0 mL，加0.05 mol.L-1的磷酸盐缓冲溶液1 mL(pH=7.4)，混匀，再加入环己烷-异丙醇(96∶4)混合液5 mL，振荡提取5 min。取上层提取液4.5 mL，氮气吹干，残渣加0.5 mL流动相溶解，振荡3 min，15 000 r.min-1离心10 min。精密吸取上清液50 μL进样分析，用外标法计算。
3 结果
3.1 方法专属性 将空白血浆的色谱图与血浆中加入NCD得到的色谱图进行比较，证明血浆中的内源性物质不干扰NCD测定，见图1，而在此色谱条件下，NCD的保留时间为15.3 min。
图1 高效液相色谱测定NCD血药浓度色谱图
, 百拇医药
A.血浆样品 B.NCD对照品 C.空白血浆
1.NCD
3.2 标准曲线和线性范围 取空白血浆6份，每份1 mL，依次加入NCD对照品110，220，440，660，880，1100 ng，混匀后，照“样品预处理”项下操作，依次测定NCD各浓度点的峰面积(A)，以NCD的峰面积(A)与进样量m(ng)进行线性回归，重复3次，得平均回归方程为：
A=802.22m-369.03 r=0.998 1 n=3
NCD的线性范围为11～110 ng，最低检测限为10 ng(S/N≥3)。
3.3 回收率及精密度
取空白血浆2份，每份1 mL，各加入220 ng及440 ng的NCD对照品混匀后，照“样品预处理”项下操作，按加样回收率方法计算，重复3次，结果见表1。
, 百拇医药
表1 血浆中尼卡地平的方法回收率实验结果表(n=5) 加入量/ng
平均回收率/%
RSD/%
220
98.27
3.72
440
100.4
4.38
取空白血浆1 mL，精密加入110，220，440 ng的NCD对照品混匀后，照“样品预处理”项下操作，进行日内及日间(5 d)精密度考察。结果见表2。
, 百拇医药
3.4 药代动力学研究 照“样品采集”和“样品预处理”项下操作，对健康家兔口服给药(NCD原料药)后的药代动力学进行研究。所得药-时数据经3P87程序软件处理后，得各药代动力学参数。家兔一次灌胃NCD(40 mg.kg-1)后主要药动学参数Logt=(0.454±0.032)h，V/F=(0.242±0.015)mg.ng-1.mL，t1/2(Ke)=(5.339±0.754)h，t1/2(Ka)=(0.812±0.086)h，Tmax=(3.04±0.93)h，Cmax=(919.245±54.40)μg.L-1，AUC=(9932.85±515.92)μg.h.L-1,n=5，平均药-时曲线见图2。
表2 血浆中尼卡地平精密度测定结果 (n=5) 加入量/ng
, 百拇医药
日内RSD/%
日间RSD/%
110
2.67
2.13
220
3.85
4.62
440
4.37
3.61
图2 家兔一次性灌胃NCD(40 mg.kg-1)后
, 百拇医药
平均血药浓度-时间曲线
4 讨论
4.1 NCD属弱碱性药物，采用液-液萃取法提取血浆中的NCD，应特别注意提取介质酸碱度的控制。酸性条件下NCD易成盐不利于有机溶剂提取，而且血浆蛋白干扰严重，影响色谱分离。经反复试验，本文采用中性偏碱的提取条件，用0.05 mol.L-1磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)控制提取介质的pH，使大部分NCD以分子形式存在，保证提取效率的同时减少了血浆蛋白的干扰。
4.2 萃取剂分别考察了醋酸乙酯、乙醚、正己烷、环己烷、环己烷与异丙醇混合液，结果醋酸乙酯对NCD提取效率不高。环己烷与异丙醇混合液的提取效率较好，只是在震荡提取时易乳化，故在提取时应加入适量NaCl。
4.3 由方法学考察可见本法准确、灵敏、专一，可满足对血药浓度分析的要求。利用本法对NCD在家兔体内的药代动力学进行了研究，结果表明对家兔一次性灌胃NCD后血浆C-t曲线呈一室一级模型。从药代动力学参数可以看出，NCD原料药给家兔灌胃后吸收较慢，存在一滞后时间(Log t=0.454 h)，达峰时间(tmax)为3.04 h；且消除半衰期较长(t1/2(Ke))为5.339 h，因此在连续给药时应考虑NCD在体内的蓄积。
, 百拇医药
国家自然科学基金资助课题(批准号 39770856)
参考文献
1，腾天申节译，曾昭瑞校.第二代二氢吡啶类钙离子拮抗剂.国外药学.合成药生化药制剂分册，1998，9(6)：334
2，齐美玲，王雅雯，郑俊民等.尼卡地平缓释片的含量测定方法研究.沈阳药科大学学报，1996，13(1)：50
3，李克，张昕，赵飞浪等.高效液相色谱法测定人血浆中尼卡地平及药代动力学参数.中国药理学报，1998，29：197
(本文于1999年12月13日收到), 百拇医药
单位：王嗣岑 贺浪冲(西安医科大学药学院 710061)
关键词：尼卡地平；钙拮抗剂；药动学；高效液相色谱
药物分析杂志000306 摘要 目的：建立兔血浆中钙拮抗剂尼卡地平的反相高效液相色谱分析方法，并对其在兔体内的药代动力学进行研究。方法：血浆样品在弱碱性条件下经环己烷-异丙醇(96∶4)提取，用LiChrosorb C18反相柱，甲醇-水(75∶25)为流动相，流速1.0 mL.min-1，检测波长236 nm等条件下，分析测定。结果：方法平均回收率为98.27%～100.4%，RSD<5.0%，线性范围：11～110 ng(r=0.998 1)，最低检测限为10 ng。结论：本法操作简便、准确灵敏、重现性好，可用于尼卡地平的药动学研究。
, 百拇医药
Determination and Pharmacokinetic Study of Nicardipine
in Rabbit by High Performance Liquid Chromatography
Wang Sicen，He Langchong
(College of Pharmacy Xi′an Medical University，Xi′an 710061)
Abstract Objective：To establish HPLC method for determination and pharmacokinetic study of nicardipine in rabbit.Methods:The blood samples were diluted by 0.05 mol.L-1 Na2HPO4 buffer solution(pH=7.4) and extracted with cyclohexane-2-propanol(96∶4).The LiChrosorb C18 column(150 mm×4.6 mm，5 μm)was used as analytical column.The mobile phase consisted of methanol-water(75∶25).The flow rate was 1.0 mL.min-1 with UV detection at 236 nm.Results:The recovery of the method was 98.27%～100.4%，RSD<5.0%.The linear range was 11～110 ng(r=0.998 1) and determination limit was 10 ng.Conclusion:The method had a good selectivity、sensitivity and reproducibility and can be used for pharmacokinetic studies of nicardipine in rabbit plasma.
, 百拇医药
Key words nicardipine,calcium antagonists,pharmacokinetics,HPLC
尼卡地平(Nicardipine,NCD)属1，4-二氢吡啶类钙拮抗剂，为血管扩张型降压药。通过抑制细胞外Ca2+的内流、松弛血管平滑肌而起到降压作用，主要用于低、中度高血压病[1]。文献报道有紫外法[2]、高效液相色谱法[3]等方法测定血浆中的NCD。在文献的基础上本文对NCD的提取方法及高效液相色谱条件进行了研究，建立了一种反相高效液相色谱(RP-HPLC)方法，用于对兔血浆中NCD的浓度进行分析测定，并对其在兔体内的药代动力学进行研究。
1 试剂与仪器
NCD对照品(美国Sigma公司)，NCD原料药(西北第二合成药厂)。环己烷、异丙醇为分析纯；甲醇为色谱纯；水为三重蒸馏水。其余试剂均为分析纯。
, 百拇医药
Shimadzu 10Avp高效液相色谱仪，配置SPD-10A vp型可调波长检测器，LC10-A vp型溶剂输送泵，HP3395A数据处理机；Herlme ZK401高速冷冻离心机；SK-1型快速混匀器。
2 实验方法
2.1 色谱条件 色谱柱LiChrosorb C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相为甲醇-水(75∶25)，使用前用0.45 μm滤膜减压过滤，超声除气；检测波长236 nm；流速1 mL.min-1。
2.2 NCD对照品溶液的配制 精密称取NCD对照品适量，加甲醇溶解并定容至10 mL，即得浓度为0.22 mg.mL-1的对照品溶液。
2.3 样品采集 取健康家兔5只，雌雄不限，体重(1.9±0.3)kg，由西安医科大学实验动物中心提供。另取NCD原料药研磨成细粉，混悬于生理盐水中，按每公斤体重40 mg的剂量灌胃给药。于灌胃前及灌胃后0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，10，24 h耳动脉采血2 mL，肝素抗凝，3 000 r.min-1离心制成血浆。
, http://www.100md.com
2.4 样品预处理 取血浆1.0 mL，加0.05 mol.L-1的磷酸盐缓冲溶液1 mL(pH=7.4)，混匀，再加入环己烷-异丙醇(96∶4)混合液5 mL，振荡提取5 min。取上层提取液4.5 mL，氮气吹干，残渣加0.5 mL流动相溶解，振荡3 min，15 000 r.min-1离心10 min。精密吸取上清液50 μL进样分析，用外标法计算。
3 结果
3.1 方法专属性 将空白血浆的色谱图与血浆中加入NCD得到的色谱图进行比较，证明血浆中的内源性物质不干扰NCD测定，见图1，而在此色谱条件下，NCD的保留时间为15.3 min。
图1 高效液相色谱测定NCD血药浓度色谱图
, 百拇医药
A.血浆样品 B.NCD对照品 C.空白血浆
1.NCD
3.2 标准曲线和线性范围 取空白血浆6份，每份1 mL，依次加入NCD对照品110，220，440，660，880，1100 ng，混匀后，照“样品预处理”项下操作，依次测定NCD各浓度点的峰面积(A)，以NCD的峰面积(A)与进样量m(ng)进行线性回归，重复3次，得平均回归方程为：
A=802.22m-369.03 r=0.998 1 n=3
NCD的线性范围为11～110 ng，最低检测限为10 ng(S/N≥3)。
3.3 回收率及精密度
取空白血浆2份，每份1 mL，各加入220 ng及440 ng的NCD对照品混匀后，照“样品预处理”项下操作，按加样回收率方法计算，重复3次，结果见表1。
, 百拇医药
表1 血浆中尼卡地平的方法回收率实验结果表(n=5) 加入量/ng
平均回收率/%
RSD/%
220
98.27
3.72
440
100.4
4.38
取空白血浆1 mL，精密加入110，220，440 ng的NCD对照品混匀后，照“样品预处理”项下操作，进行日内及日间(5 d)精密度考察。结果见表2。
, 百拇医药
3.4 药代动力学研究 照“样品采集”和“样品预处理”项下操作，对健康家兔口服给药(NCD原料药)后的药代动力学进行研究。所得药-时数据经3P87程序软件处理后，得各药代动力学参数。家兔一次灌胃NCD(40 mg.kg-1)后主要药动学参数Logt=(0.454±0.032)h，V/F=(0.242±0.015)mg.ng-1.mL，t1/2(Ke)=(5.339±0.754)h，t1/2(Ka)=(0.812±0.086)h，Tmax=(3.04±0.93)h，Cmax=(919.245±54.40)μg.L-1，AUC=(9932.85±515.92)μg.h.L-1,n=5，平均药-时曲线见图2。
表2 血浆中尼卡地平精密度测定结果 (n=5) 加入量/ng
, 百拇医药
日内RSD/%
日间RSD/%
110
2.67
2.13
220
3.85
4.62
440
4.37
3.61
图2 家兔一次性灌胃NCD(40 mg.kg-1)后
, 百拇医药
平均血药浓度-时间曲线
4 讨论
4.1 NCD属弱碱性药物，采用液-液萃取法提取血浆中的NCD，应特别注意提取介质酸碱度的控制。酸性条件下NCD易成盐不利于有机溶剂提取，而且血浆蛋白干扰严重，影响色谱分离。经反复试验，本文采用中性偏碱的提取条件，用0.05 mol.L-1磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)控制提取介质的pH，使大部分NCD以分子形式存在，保证提取效率的同时减少了血浆蛋白的干扰。
4.2 萃取剂分别考察了醋酸乙酯、乙醚、正己烷、环己烷、环己烷与异丙醇混合液，结果醋酸乙酯对NCD提取效率不高。环己烷与异丙醇混合液的提取效率较好，只是在震荡提取时易乳化，故在提取时应加入适量NaCl。
4.3 由方法学考察可见本法准确、灵敏、专一，可满足对血药浓度分析的要求。利用本法对NCD在家兔体内的药代动力学进行了研究，结果表明对家兔一次性灌胃NCD后血浆C-t曲线呈一室一级模型。从药代动力学参数可以看出，NCD原料药给家兔灌胃后吸收较慢，存在一滞后时间(Log t=0.454 h)，达峰时间(tmax)为3.04 h；且消除半衰期较长(t1/2(Ke))为5.339 h，因此在连续给药时应考虑NCD在体内的蓄积。
, 百拇医药
国家自然科学基金资助课题(批准号 39770856)
参考文献
1，腾天申节译，曾昭瑞校.第二代二氢吡啶类钙离子拮抗剂.国外药学.合成药生化药制剂分册，1998，9(6)：334
2，齐美玲，王雅雯，郑俊民等.尼卡地平缓释片的含量测定方法研究.沈阳药科大学学报，1996，13(1)：50
3，李克，张昕，赵飞浪等.高效液相色谱法测定人血浆中尼卡地平及药代动力学参数.中国药理学报，1998，29：197
(本文于1999年12月13日收到), 百拇医药