肾舒冲剂澄清工艺的研究
作者：王曙东 宋炳生 周军 陶建生
单位：王曙东 宋炳生 周军(南京军区南京总医院 210002)；陶建生(上海中医药大学)
关键词：
中草药000314 肾舒冲剂为卫生部药品标准收载，采用水提醇沉工艺制备。本实验分别用壳聚糖、乙醇对其水提液作澄清处理，以处方中主药黄柏所含成分小檗碱为指标，进行含量比较，并以正交设计法优选壳聚糖的最佳澄清工艺。
1 药品、试剂和仪器
中药材购自上海市药材公司；小檗碱对照品购于中国药品生物制品检定所；壳聚糖购于华东理工大学理学院华凯科技贸易公司，用1%醋酸配成1%壳聚糖溶液；所用试剂均为AR。
仪器：色谱仪系统包括UV200紫外可变波长检测器，P200高压恒流泵(大连化物所)，GJ-605型高压六通进样阀(进样杯体积20 μL)，WDL-95色谱工作站(国家色谱中心)，色谱柱：Sperisorb C18 5 μm 4.6 mm×250 mm(大连化物所)。
, 百拇医药
2 小檗碱的含量测定方法
2.1 色谱条件：流动相为乙腈-0.04 mol/L H3PO4(42∶58)，检测波长349 nm，流速1.0 mL/min，柱温：室温。色谱图见图1。
2.2 标准曲线：精密称取105 ℃干燥至恒重的小檗
A-对照品 s-小檗碱 B-肾舒冲剂 C-空白
图1 样品色谱图
碱2.4 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，为240 μg/mL对照品溶液。取5 mL加甲醇至10 mL得120 μg/mL对照品溶液，分别取0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 mL于10 mL溶量瓶中，加甲醇至刻度。液相色谱仪测定，进样量20 μL，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y=26 309.60X-355.42，r=0.999 8，小檗碱在1.2～19.2 μg/mL范围内峰面积与进样浓度呈线性关系。
, 百拇医药
2.3 精密度试验：精密吸取小檗碱对照品液(0.03 μg/mL) 0.5 mL于10 mL容量瓶中，加流动相至刻度，连续进样5次，每次20 μL，得平均峰面积值为48 122，RSD为0.60%。
2.4 重现性试验：平行取处方水煎液10 mL(相当含黄柏2 g)5份于三角瓶中，水浴挥干，依法测定峰面积，得小檗碱面积均值为402 320，RSD为2.50%。
2.5 回收率试验：精密吸取已知小檗碱含量的水煎液，精密加入小檗碱对照品，依法测定，结果回收率为89.99%，RSD=3.9%(n=4)。
3 不同澄清液澄清工艺的比较
3.1 不同澄清剂的澄清工艺：取处方水提液10 mL(相当含黄柏2 g)各3份，按下述方法分别处理：1号：40 %乙醇沉淀，过滤，滤液水浴挥干；2号：40 %壳聚糖溶液沉淀，80 ℃水浴加热片刻至澄清，过滤，滤液水浴挥干；3号：未经任何澄清处理，直接水浴挥干。
, http://www.100md.com
3.2 样品处理与测定结果：取上述样品分别加入10 mL氯仿，超声提取10 min，过滤，挥干氯仿，残渣甲醇溶解并定容10 mL，取50 μL加入150 μL流动相混匀，注入液相色谱仪，进样量20 μL。结果见表1。
表1 不同澄清方法的肾舒冲剂样品的含量测定 编 号
平均值
(n=3)
RSD
(%)
1峰面积
12 170
7.75
浓度(μg/mL)
, http://www.100md.com
4.64
2峰面积
107 600
4.50
浓度(μg/mL)
4.10
3峰面积
154 300
4.37
浓度(μg/mL)
5.58
4 正交设计优选壳聚糖最佳澄清工艺
, http://www.100md.com
4.1 试验因素与因素水平的确定：根据壳聚糖本身的特点以及实际应用的情况，确定影响澄清效果的相关因素：壳聚糖加入量、药液浓度、药液的pH值，利用L9(34)正交表进行试验，其因素水平设置如下：
因素A＃ 壳聚糖加入量：A1=1.0 mL，A2=2.0 mL，A3=4.0 mL
因素B＃ 药液浓度(g/mL)：B1=2.0，B2=1.0，B3=0.5
因素C＃ 药液的pH值：C1=4，C2=5，C3=6。
4.2 结果与分析：按L9(34)正交设计表所设定的工艺条件试验，结果见表2，3。
, 百拇医药
实验结果表明，壳聚糖处理的样品含量较醇沉法略低，都低于未处理样品，正交试验方差分析表明，壳聚糖加入量、药液浓度、药液的pH，在所选择表2 壳聚糖澄清工艺的正交试验结果 试验号
A
B
C
峰面积
浓度
1
2
3
4
(μg/mL)
, 百拇医药 1
1
1
1
1
129 200
4.92
2
1
2
2
2
129 300
4.93
, http://www.100md.com
3
1
3
3
3
115 800
4.41
4
2
1
2
3
111 800
4.26
, 百拇医药
5
2
2
3
1
124 500
4.75
6
2
3
1
2
120 600
4.60
, 百拇医药
7
3
1
3
2
108 700
4.15
8
3
2
1
3
116 100
4.43
, 百拇医药
9
3
3
2
1
88 980
3.40
Ⅰ
14.26
13.33
13.95
13.07
Ⅱ
, http://www.100md.com
13.61
14.11
12.59
13.68
Ⅲ
11.98
12.41
13.31
13.10
Ⅰ
4.75
4.44
4.65
, http://www.100md.com
4.36
Ⅱ
4.54
4.70
4.20
4.56
Ⅲ
3.99
4.14
4.44
4.37
R
0.76
, http://www.100md.com
0.56
0.45
0.19
Rj
532.10
530.79
530.27
529.58
Rj=Ⅰ2+Ⅱ2+Ⅲ2
Sj=Rj/3-CT
0.92
0.48
, http://www.100md.com
0.31
0.077
CT=(ΣX)2/n=176.45
表3 壳聚糖澄清工艺的方差分析 变异来源
L
V
MS
F
A
0.92
2
0.46
, http://www.100md.com 11.95
B
0.48
2
0.24
6.23
C
0.31
2
0.155
4.03
误差
0.077
2
0.0385
F0.05(2.2)=19.0
的3个水平中对样品含量的影响无显著性差异。直观分析可知因素主次关系为A、B、C，较好的方案为A1B2C1。
(收稿日期：1999-03-11), http://www.100md.com
单位：王曙东 宋炳生 周军(南京军区南京总医院 210002)；陶建生(上海中医药大学)
关键词：
中草药000314 肾舒冲剂为卫生部药品标准收载，采用水提醇沉工艺制备。本实验分别用壳聚糖、乙醇对其水提液作澄清处理，以处方中主药黄柏所含成分小檗碱为指标，进行含量比较，并以正交设计法优选壳聚糖的最佳澄清工艺。
1 药品、试剂和仪器
中药材购自上海市药材公司；小檗碱对照品购于中国药品生物制品检定所；壳聚糖购于华东理工大学理学院华凯科技贸易公司，用1%醋酸配成1%壳聚糖溶液；所用试剂均为AR。
仪器：色谱仪系统包括UV200紫外可变波长检测器，P200高压恒流泵(大连化物所)，GJ-605型高压六通进样阀(进样杯体积20 μL)，WDL-95色谱工作站(国家色谱中心)，色谱柱：Sperisorb C18 5 μm 4.6 mm×250 mm(大连化物所)。
, 百拇医药
2 小檗碱的含量测定方法
2.1 色谱条件：流动相为乙腈-0.04 mol/L H3PO4(42∶58)，检测波长349 nm，流速1.0 mL/min，柱温：室温。色谱图见图1。
2.2 标准曲线：精密称取105 ℃干燥至恒重的小檗
A-对照品 s-小檗碱 B-肾舒冲剂 C-空白
图1 样品色谱图
碱2.4 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，为240 μg/mL对照品溶液。取5 mL加甲醇至10 mL得120 μg/mL对照品溶液，分别取0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 mL于10 mL溶量瓶中，加甲醇至刻度。液相色谱仪测定，进样量20 μL，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y=26 309.60X-355.42，r=0.999 8，小檗碱在1.2～19.2 μg/mL范围内峰面积与进样浓度呈线性关系。
, 百拇医药
2.3 精密度试验：精密吸取小檗碱对照品液(0.03 μg/mL) 0.5 mL于10 mL容量瓶中，加流动相至刻度，连续进样5次，每次20 μL，得平均峰面积值为48 122，RSD为0.60%。
2.4 重现性试验：平行取处方水煎液10 mL(相当含黄柏2 g)5份于三角瓶中，水浴挥干，依法测定峰面积，得小檗碱面积均值为402 320，RSD为2.50%。
2.5 回收率试验：精密吸取已知小檗碱含量的水煎液，精密加入小檗碱对照品，依法测定，结果回收率为89.99%，RSD=3.9%(n=4)。
3 不同澄清液澄清工艺的比较
3.1 不同澄清剂的澄清工艺：取处方水提液10 mL(相当含黄柏2 g)各3份，按下述方法分别处理：1号：40 %乙醇沉淀，过滤，滤液水浴挥干；2号：40 %壳聚糖溶液沉淀，80 ℃水浴加热片刻至澄清，过滤，滤液水浴挥干；3号：未经任何澄清处理，直接水浴挥干。
, http://www.100md.com
3.2 样品处理与测定结果：取上述样品分别加入10 mL氯仿，超声提取10 min，过滤，挥干氯仿，残渣甲醇溶解并定容10 mL，取50 μL加入150 μL流动相混匀，注入液相色谱仪，进样量20 μL。结果见表1。
表1 不同澄清方法的肾舒冲剂样品的含量测定 编 号
平均值
(n=3)
RSD
(%)
1峰面积
12 170
7.75
浓度(μg/mL)
, http://www.100md.com
4.64
2峰面积
107 600
4.50
浓度(μg/mL)
4.10
3峰面积
154 300
4.37
浓度(μg/mL)
5.58
4 正交设计优选壳聚糖最佳澄清工艺
, http://www.100md.com
4.1 试验因素与因素水平的确定：根据壳聚糖本身的特点以及实际应用的情况，确定影响澄清效果的相关因素：壳聚糖加入量、药液浓度、药液的pH值，利用L9(34)正交表进行试验，其因素水平设置如下：
因素A＃ 壳聚糖加入量：A1=1.0 mL，A2=2.0 mL，A3=4.0 mL
因素B＃ 药液浓度(g/mL)：B1=2.0，B2=1.0，B3=0.5
因素C＃ 药液的pH值：C1=4，C2=5，C3=6。
4.2 结果与分析：按L9(34)正交设计表所设定的工艺条件试验，结果见表2，3。
, 百拇医药
实验结果表明，壳聚糖处理的样品含量较醇沉法略低，都低于未处理样品，正交试验方差分析表明，壳聚糖加入量、药液浓度、药液的pH，在所选择表2 壳聚糖澄清工艺的正交试验结果 试验号
A
B
C
峰面积
浓度
1
2
3
4
(μg/mL)
, 百拇医药 1
1
1
1
1
129 200
4.92
2
1
2
2
2
129 300
4.93
, http://www.100md.com
3
1
3
3
3
115 800
4.41
4
2
1
2
3
111 800
4.26
, 百拇医药
5
2
2
3
1
124 500
4.75
6
2
3
1
2
120 600
4.60
, 百拇医药
7
3
1
3
2
108 700
4.15
8
3
2
1
3
116 100
4.43
, 百拇医药
9
3
3
2
1
88 980
3.40
Ⅰ
14.26
13.33
13.95
13.07
Ⅱ
, http://www.100md.com
13.61
14.11
12.59
13.68
Ⅲ
11.98
12.41
13.31
13.10
Ⅰ
4.75
4.44
4.65
, http://www.100md.com
4.36
Ⅱ
4.54
4.70
4.20
4.56
Ⅲ
3.99
4.14
4.44
4.37
R
0.76
, http://www.100md.com
0.56
0.45
0.19
Rj
532.10
530.79
530.27
529.58
Rj=Ⅰ2+Ⅱ2+Ⅲ2
Sj=Rj/3-CT
0.92
0.48
, http://www.100md.com
0.31
0.077
CT=(ΣX)2/n=176.45
表3 壳聚糖澄清工艺的方差分析 变异来源
L
V
MS
F
A
0.92
2
0.46
, http://www.100md.com 11.95
B
0.48
2
0.24
6.23
C
0.31
2
0.155
4.03
误差
0.077
2
0.0385
F0.05(2.2)=19.0
的3个水平中对样品含量的影响无显著性差异。直观分析可知因素主次关系为A、B、C，较好的方案为A1B2C1。
(收稿日期：1999-03-11), http://www.100md.com