特超强毒型马立克病病毒囊膜糖蛋白I基因序列及与其它致病型毒株的比较
作者：崔治中 何良梅
单位：扬州大学畜牧兽医学院兽医系，扬州 225009
关键词：马立克病病毒；糖蛋白I基因；序列比较
中国病毒学000213 摘要：特超强毒型648A株马立克病病毒(MDV)的囊膜糖蛋白I(gI)基因经PCR扩增后克隆进pUC18质粒载体，并对其ORF完成了DNA测序。与已发表的其它致病型毒株的糖蛋白I的DNA和氨基酸序列比较表明，648A株的gI基因序列与超强毒RBIB株已发表的ORF 5′端761个碱基完全相同。但是在该基因中完整ORF的1068个碱基中，648A株与强毒GA株间有8个碱基变异并导致7个氨基酸的变化，且这一变化主要发生在该基因的5′端，其3′端三分之一完全相同。
中图分类号：S852.65 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0180-08
, 百拇医药
Comparing DNA Sequences in Glycoprotein I Gene of Marek's Disease Viruses of Different Pathotypes
CUI Zhi-zhong,HE Liang-mei
(Dept.of Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)
Abstract:The glycoprotein I gene (gI) of vv+MDV strain 648A was amplified by PCR,cloned and sequenced,its DNA and amino acid sequences were compared to published sequences of vMDV strain GA and vvMDV strain RB1B.The results indicated that the gI sequence of 648A was identical to the published 761 bases of 5′ side of ORF of strain RBIB,but there were 8 bases and then 7 amino acids different between GA and 648A strains.All these base changes located at the 5′-end of gI,about the one third of the 3′-end was identical in different pathotypes.
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Key word:Marek's disease virus; Glycoprotein I gene; DNA sequence
30年来，随着抗马立克病(MD)疫苗的广泛应用和不断改进，在鸡群中流行的马立克病病毒(MDV)的毒力或致病性也在不断演化中。从60年代前流行毒株以弱毒(mMDV)为主，逐渐产生了强毒株(vMDV)、超强毒株(vvMDV)和特超强毒株(vv+MDV)[1，2]。针对不同致病型毒株流行的鸡群应该选用的疫苗种类也不一样。为了鉴别不同的致病型毒株，目前还没有找到一种体外试验方法。
迄今为止，MDV的8个囊膜糖蛋白基因均已克隆和测序，但只在糖蛋白B基因(gB)才对不同致病型毒株进行了MDA序列比较。结果发现，该基因的DNA和氨基酸序列非常保守，几个mMDV、vMDV和vvMDV株的序列几乎完全一致(Ross et al.,1989[3]; Lee et al.,个人通讯)；Heine et al.,1997[4]；彭大新等，待发表资料)。鉴于vMDV的GA株糖蛋白I基因(gI)全序列和vvMDV的RB1B株gI的部分序列已发表[5，6]，且已显出一些株间差异，本研究试图扩增和克隆vv+MDV的648A株[2]的gI基因，进而比较分析分属vMDV\,vvMDV\,vv+MDV不同致病型的GA、RB1B和648A三株MDVgI基因的DNA和氨基酸序列，以探索从分子水平来区别不同致病型毒株的可能性。
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1 材料和方法
1.1 特超强毒MDV株
648A株是迄今已发表的特超强毒MDV(vv+MDV)中毒力最强的一株病毒[2]，从648A感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)提取的基因组DNA由美国农业部禽病和肿瘤学研究所提供。
1.2 糖蛋白I基因的PCR扩增克隆和定序
1.2.1 PCR引物 为了从648A株病毒基因组DNA中扩增gI基因，根据已发表的强毒型GA株gI基因序列[6]，设计并合成了一对引物：5′-CGATCTAGATAGACGGCGTGTGTGA(相当于gI的ORF上游的-24至-7并加入一个XbaI酶切位点)和5′-CTAACAGGTACCACCTACC(相当于ORF的+1105至此+1088，其中已含一个KpnI酶切位点)。
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1.2.2 PCR扩增按常规方法进行，程序为：在95℃变性5min后，按95℃(1min)、52℃(2min)和72℃(2min)做35个循环，最后在72℃下5min结束。PCR扩增产物在经酒精沉淀后再溶于少量TE缓冲液(0.01mol/L Tris,0.001mol/L EDTA,pH8.0)中。
1.2.3 分别将PCR产物和pUC18质粒DNA经XbaI和KpnI双酶消化后作琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶上切下相应大小的DNA条带，用QIAGEN公司的试剂盒从凝胶中回收相应条带的DNA。将经XbaI和KpnI双酶切的PCR产物及pUC18质粒DNA用连接酶连接后转化TG1株大肠杆菌。将转化菌接种在含ampicilin的LB琼脂平板上于37℃培养，分别取白色菌落在LB培养液中扩大培养后按常规方法提取质粒DNA，再用XbaI和KpnI双酶切后作琼脂糖凝胶电泳，根据插入DNA片段的大小来筛选阳性重组质粒。
1.2.4 DNA测序，委托中国科学院上海植物生理所用DNA自动测序仪完成。
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1.3 蛋白质构象的比较分析
用SEQAID程序，对648A和GA二株病毒在gI蛋白质可能的亲水疏水性和二级结构的一些特性方面分别一一做对应比较。
2 结果
2.1 MDV的三个不同致病型毒株的囊膜糖蛋白I基因DNA序列比较
图1 列出了特超强毒型648A株MDV的囊膜糖蛋白I基因ORF的DNA序列，文献中已发表的超强毒型RB1B株及强毒型GA株的序列也排列在一起作比较。图1可见，648A株(vv+MDV)gI的ORF在DNA序列上有8个碱基不同于GA株(vMDV)，且都发生在5′端，而3′端的三分之一完全相同。然而已完成并发表的RB1B(vvMDV)5′端的761个碱基则与648A株完全相同。
2.2 MDV的三个不同致病型毒株的囊膜糖蛋白氨基酸序列比较
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由三个毒株gI基因的DNA序列推测出的氨基酸序列见图2，在648A株与GA株间DNA序列上的8个碱基变化，有7个是有义变异，导致了相应7个氨基酸组成的变化，另一个碱基突变(在第552碱基)为无义突变。
2.3 GA株和648A株gI蛋白质的亲水性、疏水性比较
用SEQAID程序对二个毒株的gI蛋白的亲疏水性比较表明，虽然每一个氨基酸变化都影响相应位点的亲疏水性，但以ORF的第176个氨基酸的变化的影响最大。如图3所示，在该位点，从648A株的疏水性亮氨酸(L)变为GA株的亲水性的组氨酸(H)后，使相临的170～176aa区由疏水性变为亲水性。
2.4 GA株和648A株gI蛋白质二级结构相关特性的比较
不同毒株gI蛋白质上一些氨基酸的变化，也可能导致与蛋白质二级结构相关特性的变化，如α-螺旋(helix)或β-平板(sheet)及肽链折转(turn)或随机绕缠(random coil)等。由图4可见，在GA株和648A株间，由于在112和155位的氨基酸的变异(分别从G变为D和从V变为A)，可能导致在相应区域的肽链折转位点的移动和由β-平板结构变为α-螺旋结构(下双划线区)。
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图1 强毒超强毒和特超强毒株MDV的囊膜糖蛋白I基因ORF的DNA序列同源性比较。“-”表示同样碱基，GA和RB1B株序列来自Brunovskis(1994)和Ross(1991)，但发表资料中RB1B株的序列没有全部完成。
Fig.1 Comparing the DNA sequences in ORF of glycoprotein I genes from vMDV,vvMDV and vv+MDV.“-” indicates the identical bases.Data of GA and RB1B strains are from published date (Brunovskis et al.,1994; Ross et al.,1991),but the sequence of RB1B was not completed.
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图2 强毒(GA)超强毒(RB1B)和特超强毒(648A)株MDV囊膜糖蛋白I氨基酸序列比较
图中“-”表示相同。RB1B株的序列原发表资料没有全部完成。
Fig.2 Comparing amino acid sequences of glycoprotein I from MDV strains GA (vMDV),RB1B (vvMDV) and 648A (vv+MDV).
“-”indicates the identical amino acid,the sequence of RB1B was not finished in the published data.
3 讨论
根据HVT单价苗或HVT和SB1双价苗免疫的鸡群中用特定MDV毒株人工攻毒后MD的发病率，可以确定不同野毒株的毒力指数(virulent index)，不同毒力的MDV野毒株可区别为mMDV、vMDV、vvMDV和vv+MDV[2]。以JM株和Md5株分别作为vMDV和vvMDV的参考株原型，如果在非免疫鸡群，其毒力指数小于JM株，则属于mMDV。HVT疫苗免疫鸡群，其毒力指数等于JM则属vMDV，大于JM株属vvMDV；HVT和SB1二价苗免疫的鸡群，其毒力指数等于Md5株则属vvMDV，大于Md5属vv+MDV[2]。这些研究结果还证明，单用HVT疫苗只能预防vMDV型毒株感染，采用HVT和SB1二价苗只能预防毒力指数低于vvMDV型毒株感染，只有I型的CVI988/Rispens株疫苗才能有效预防绝大多数流行毒株、包括vv+MDV型毒株感染。 然而， 如果盲目地普遍应用CVI988/Rispens 株疫苗， 不仅会提高生产成本，而且有可能在鸡群中造成一种疫苗选择性压力，加速更强毒株的出现，这从流行病学角度考虑也是不可取的。因此，最理想的是根据不同地区和鸡群流行毒株的毒力指数或致病型选用相应种类的疫苗。但是，按上述动物试验的方法来确定一个毒株的致病型需要大量的SPF鸡，还需在隔离条件下饲养3个月。这不仅成本高，而且经常需要4～5个月才会有结果，对生产单位很不实用，在我国现有条件下就更难实施。
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图3 648株(上)和GA株(下)糖蛋白I第167-181氨基酸间的亲(0线左侧)疏(0线右侧)水性比较，阴影区为由第176氨基酸突变引起的显著不同区。
图中2列数字中，左列代表各氨基酸单独的疏水性数值(负数表示亲水)。右列代表与相临6个氨基酸相互作用下疏水性数值的均数。
Fig.3 Comparison of hydrophobicity in the region of 167 th-181 th aa of gI between strains 648 A and GA.The sha-dowed area indicates the area with difference.
图4 648A和GA株gI蛋白质二级结构特性的比较
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图中仅显示第81-180aa区，“*”表示二病毒株在该位点的氨基酸不同。648A和GA株的多肽链下的符号表示二级结构的特性，其中“H”“E”“T”“C”的含义见本图顶端第3行，下划双线区表示二株病毒在二级结构上不同的区域。
Fig.4 Comparison of 648 A and GA strains for their gI protein secondary structures.
In the figure,only 81 th-180 th aa are demonstrated.“*” indicates different aa at the site.Lines under peptide of strains 648A and GA represent the predicted secondary structures of gI proteins,the top 3rd line indicates the meanings of “H” “E” “T” “C”，the changed areas in their secondary structures are double-underlined.
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最近几年来，各国科学家都试图用体外试验来鉴别不同致病型的MDV野毒株。比如，用PCR技术已证明，I型MDV在CEF上经多次连续传代后，其基因组上132bp重复片段的拷贝数显著增加[7，8]。但是，在不同致病型的原始野毒间，这一差异并不明显。由于MDV全基因组DNA的测序已接近完成(Lee et al.,个人通讯)，再加上现代重组DNA技术的迅速改进和DNA测序商业化，使扩增、克隆和定序一段DNA变得非常容易，因而有可能用来比较某些基因的DNA变异与其致病型的相关性。鉴于与MDV感染细胞活性密切相关的8个囊膜糖蛋白(gB、C、D、E、G、H、I、K、L)的序列都已发表[3，5，6，9，10，11，12]，使我们对比较不同毒株的糖蛋白基因感兴趣。在目前已知的与抗感染免疫最可能相关的gB、gE和gI三个基因中，已发现gB非常保守，vvMDV的RB1B株[3]、vMDV的GA株(Lee et al.,个人通讯)、疫苗毒CVI988株(彭大新等，待发表资料)和一个毒力很强的澳大利亚株[13]的gB基因DNA序列居然完全一致。然而gI基因却易发生变化[5，6]，因此本研究从gI着手。
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本研究选用来扩增和测定gI基因DNA序列的648A株MDV是特超强毒MDV中毒力指数最高的一株[2]，容易发现它与其它致病型之间的差别。结果表明，648A株的gI基因的DNA序列与已部分完成并发表的超强毒RB1B株的5′端的761个碱基完全相同，而648A株的gI全基因组DNA则与强毒GA株有8个碱基变异，并引起7个氨基酸突变。虽然PCR可能会造成人为的突变，本研究也只对选定的一个克隆测序，但由于648A株和GA株之间的差别仅发生在第667碱基及其上游的5′端，而648A株的第761碱基以前的5′端与RB1B株的761个碱基完全相同，这表明648A株与GA株间的差别确是原648A株病毒固有的，不是在PCR过程中产生的人为突变。
用SEQAID程序对648A和GA株gI序列的分析发现，其中有些氨基酸的变化可能导致亲疏水性及与蛋白质二级结构相关特性的变化。当然，这一结构变化与病毒致病性的关系还有待分析更多的毒株。但根据本研究对vMDV\,vvMDV和vv+MDV三个不同致病型毒株的比较分析，至少已初步表明，MDV的gI的变异主要发生在其5′端，因而，对gI的序列比较只要对其ORF的5′端的700个以内的碱基测序。此外，这一DNA序列比较可将vMDV与毒力更强的毒株区别开来，但要区别vvMDV和vv+MDV，还须选择其它基因进行分析比较。鉴于我国目前还没能按Witter[2]的标准来鉴定国内MDV流行毒株的致病型，本研究结果至少可为将vMDV型毒株与更强毒力的vvMDV和vv+MDV型的区别提供参考数据。
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利用从强毒型GA株MDV克隆到的糖蛋白gB、gE和gI基因作为目的基因，日本Neponzeon公司与美国农业部禽病和肿瘤学研究所联合研制开发了以禽痘病毒为载体的基因工程疫苗，据称其对MD的免疫保护效果要高于单一表达gB的重组FPV(Lee等，个人通讯)。本研究表明，来自特超强毒株648A的gI蛋白质成分中有7个氨基酸不同于强毒GA株，SEQAID程序分析也表明这可能在抗原性上造成差别(文中未列出)。因此，以648A株的gI基因作为目的基因进一步研制出的基因工程疫苗，将有可能对超强毒及特超强毒株MDV感染产生更有效的免疫保护作用。
国家“863”项目及国家自然科学基金资助项目的一部分
崔治中(1944年-),男,江苏江阴市人,博士、教授.主要研究方向为兽医微生物和动物病毒分子生物学.
参考文献
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1999-03-01
1999-05-04, 百拇医药
单位：扬州大学畜牧兽医学院兽医系，扬州 225009
关键词：马立克病病毒；糖蛋白I基因；序列比较
中国病毒学000213 摘要：特超强毒型648A株马立克病病毒(MDV)的囊膜糖蛋白I(gI)基因经PCR扩增后克隆进pUC18质粒载体，并对其ORF完成了DNA测序。与已发表的其它致病型毒株的糖蛋白I的DNA和氨基酸序列比较表明，648A株的gI基因序列与超强毒RBIB株已发表的ORF 5′端761个碱基完全相同。但是在该基因中完整ORF的1068个碱基中，648A株与强毒GA株间有8个碱基变异并导致7个氨基酸的变化，且这一变化主要发生在该基因的5′端，其3′端三分之一完全相同。
中图分类号：S852.65 文献标识码：A
文章编号：1003-5125(2000)02-0180-08
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Comparing DNA Sequences in Glycoprotein I Gene of Marek's Disease Viruses of Different Pathotypes
CUI Zhi-zhong,HE Liang-mei
(Dept.of Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)
Abstract:The glycoprotein I gene (gI) of vv+MDV strain 648A was amplified by PCR,cloned and sequenced,its DNA and amino acid sequences were compared to published sequences of vMDV strain GA and vvMDV strain RB1B.The results indicated that the gI sequence of 648A was identical to the published 761 bases of 5′ side of ORF of strain RBIB,but there were 8 bases and then 7 amino acids different between GA and 648A strains.All these base changes located at the 5′-end of gI,about the one third of the 3′-end was identical in different pathotypes.
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Key word:Marek's disease virus; Glycoprotein I gene; DNA sequence
30年来，随着抗马立克病(MD)疫苗的广泛应用和不断改进，在鸡群中流行的马立克病病毒(MDV)的毒力或致病性也在不断演化中。从60年代前流行毒株以弱毒(mMDV)为主，逐渐产生了强毒株(vMDV)、超强毒株(vvMDV)和特超强毒株(vv+MDV)[1，2]。针对不同致病型毒株流行的鸡群应该选用的疫苗种类也不一样。为了鉴别不同的致病型毒株，目前还没有找到一种体外试验方法。
迄今为止，MDV的8个囊膜糖蛋白基因均已克隆和测序，但只在糖蛋白B基因(gB)才对不同致病型毒株进行了MDA序列比较。结果发现，该基因的DNA和氨基酸序列非常保守，几个mMDV、vMDV和vvMDV株的序列几乎完全一致(Ross et al.,1989[3]; Lee et al.,个人通讯)；Heine et al.,1997[4]；彭大新等，待发表资料)。鉴于vMDV的GA株糖蛋白I基因(gI)全序列和vvMDV的RB1B株gI的部分序列已发表[5，6]，且已显出一些株间差异，本研究试图扩增和克隆vv+MDV的648A株[2]的gI基因，进而比较分析分属vMDV\,vvMDV\,vv+MDV不同致病型的GA、RB1B和648A三株MDVgI基因的DNA和氨基酸序列，以探索从分子水平来区别不同致病型毒株的可能性。
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1 材料和方法
1.1 特超强毒MDV株
648A株是迄今已发表的特超强毒MDV(vv+MDV)中毒力最强的一株病毒[2]，从648A感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)提取的基因组DNA由美国农业部禽病和肿瘤学研究所提供。
1.2 糖蛋白I基因的PCR扩增克隆和定序
1.2.1 PCR引物 为了从648A株病毒基因组DNA中扩增gI基因，根据已发表的强毒型GA株gI基因序列[6]，设计并合成了一对引物：5′-CGATCTAGATAGACGGCGTGTGTGA(相当于gI的ORF上游的-24至-7并加入一个XbaI酶切位点)和5′-CTAACAGGTACCACCTACC(相当于ORF的+1105至此+1088，其中已含一个KpnI酶切位点)。
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1.2.2 PCR扩增按常规方法进行，程序为：在95℃变性5min后，按95℃(1min)、52℃(2min)和72℃(2min)做35个循环，最后在72℃下5min结束。PCR扩增产物在经酒精沉淀后再溶于少量TE缓冲液(0.01mol/L Tris,0.001mol/L EDTA,pH8.0)中。
1.2.3 分别将PCR产物和pUC18质粒DNA经XbaI和KpnI双酶消化后作琼脂糖凝胶电泳后，从凝胶上切下相应大小的DNA条带，用QIAGEN公司的试剂盒从凝胶中回收相应条带的DNA。将经XbaI和KpnI双酶切的PCR产物及pUC18质粒DNA用连接酶连接后转化TG1株大肠杆菌。将转化菌接种在含ampicilin的LB琼脂平板上于37℃培养，分别取白色菌落在LB培养液中扩大培养后按常规方法提取质粒DNA，再用XbaI和KpnI双酶切后作琼脂糖凝胶电泳，根据插入DNA片段的大小来筛选阳性重组质粒。
1.2.4 DNA测序，委托中国科学院上海植物生理所用DNA自动测序仪完成。
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1.3 蛋白质构象的比较分析
用SEQAID程序，对648A和GA二株病毒在gI蛋白质可能的亲水疏水性和二级结构的一些特性方面分别一一做对应比较。
2 结果
2.1 MDV的三个不同致病型毒株的囊膜糖蛋白I基因DNA序列比较
图1 列出了特超强毒型648A株MDV的囊膜糖蛋白I基因ORF的DNA序列，文献中已发表的超强毒型RB1B株及强毒型GA株的序列也排列在一起作比较。图1可见，648A株(vv+MDV)gI的ORF在DNA序列上有8个碱基不同于GA株(vMDV)，且都发生在5′端，而3′端的三分之一完全相同。然而已完成并发表的RB1B(vvMDV)5′端的761个碱基则与648A株完全相同。
2.2 MDV的三个不同致病型毒株的囊膜糖蛋白氨基酸序列比较
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由三个毒株gI基因的DNA序列推测出的氨基酸序列见图2，在648A株与GA株间DNA序列上的8个碱基变化，有7个是有义变异，导致了相应7个氨基酸组成的变化，另一个碱基突变(在第552碱基)为无义突变。
2.3 GA株和648A株gI蛋白质的亲水性、疏水性比较
用SEQAID程序对二个毒株的gI蛋白的亲疏水性比较表明，虽然每一个氨基酸变化都影响相应位点的亲疏水性，但以ORF的第176个氨基酸的变化的影响最大。如图3所示，在该位点，从648A株的疏水性亮氨酸(L)变为GA株的亲水性的组氨酸(H)后，使相临的170～176aa区由疏水性变为亲水性。
2.4 GA株和648A株gI蛋白质二级结构相关特性的比较
不同毒株gI蛋白质上一些氨基酸的变化，也可能导致与蛋白质二级结构相关特性的变化，如α-螺旋(helix)或β-平板(sheet)及肽链折转(turn)或随机绕缠(random coil)等。由图4可见，在GA株和648A株间，由于在112和155位的氨基酸的变异(分别从G变为D和从V变为A)，可能导致在相应区域的肽链折转位点的移动和由β-平板结构变为α-螺旋结构(下双划线区)。
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图1 强毒超强毒和特超强毒株MDV的囊膜糖蛋白I基因ORF的DNA序列同源性比较。“-”表示同样碱基，GA和RB1B株序列来自Brunovskis(1994)和Ross(1991)，但发表资料中RB1B株的序列没有全部完成。
Fig.1 Comparing the DNA sequences in ORF of glycoprotein I genes from vMDV,vvMDV and vv+MDV.“-” indicates the identical bases.Data of GA and RB1B strains are from published date (Brunovskis et al.,1994; Ross et al.,1991),but the sequence of RB1B was not completed.
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图2 强毒(GA)超强毒(RB1B)和特超强毒(648A)株MDV囊膜糖蛋白I氨基酸序列比较
图中“-”表示相同。RB1B株的序列原发表资料没有全部完成。
Fig.2 Comparing amino acid sequences of glycoprotein I from MDV strains GA (vMDV),RB1B (vvMDV) and 648A (vv+MDV).
“-”indicates the identical amino acid,the sequence of RB1B was not finished in the published data.
3 讨论
根据HVT单价苗或HVT和SB1双价苗免疫的鸡群中用特定MDV毒株人工攻毒后MD的发病率，可以确定不同野毒株的毒力指数(virulent index)，不同毒力的MDV野毒株可区别为mMDV、vMDV、vvMDV和vv+MDV[2]。以JM株和Md5株分别作为vMDV和vvMDV的参考株原型，如果在非免疫鸡群，其毒力指数小于JM株，则属于mMDV。HVT疫苗免疫鸡群，其毒力指数等于JM则属vMDV，大于JM株属vvMDV；HVT和SB1二价苗免疫的鸡群，其毒力指数等于Md5株则属vvMDV，大于Md5属vv+MDV[2]。这些研究结果还证明，单用HVT疫苗只能预防vMDV型毒株感染，采用HVT和SB1二价苗只能预防毒力指数低于vvMDV型毒株感染，只有I型的CVI988/Rispens株疫苗才能有效预防绝大多数流行毒株、包括vv+MDV型毒株感染。 然而， 如果盲目地普遍应用CVI988/Rispens 株疫苗， 不仅会提高生产成本，而且有可能在鸡群中造成一种疫苗选择性压力，加速更强毒株的出现，这从流行病学角度考虑也是不可取的。因此，最理想的是根据不同地区和鸡群流行毒株的毒力指数或致病型选用相应种类的疫苗。但是，按上述动物试验的方法来确定一个毒株的致病型需要大量的SPF鸡，还需在隔离条件下饲养3个月。这不仅成本高，而且经常需要4～5个月才会有结果，对生产单位很不实用，在我国现有条件下就更难实施。
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图3 648株(上)和GA株(下)糖蛋白I第167-181氨基酸间的亲(0线左侧)疏(0线右侧)水性比较，阴影区为由第176氨基酸突变引起的显著不同区。
图中2列数字中，左列代表各氨基酸单独的疏水性数值(负数表示亲水)。右列代表与相临6个氨基酸相互作用下疏水性数值的均数。
Fig.3 Comparison of hydrophobicity in the region of 167 th-181 th aa of gI between strains 648 A and GA.The sha-dowed area indicates the area with difference.
图4 648A和GA株gI蛋白质二级结构特性的比较
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图中仅显示第81-180aa区，“*”表示二病毒株在该位点的氨基酸不同。648A和GA株的多肽链下的符号表示二级结构的特性，其中“H”“E”“T”“C”的含义见本图顶端第3行，下划双线区表示二株病毒在二级结构上不同的区域。
Fig.4 Comparison of 648 A and GA strains for their gI protein secondary structures.
In the figure,only 81 th-180 th aa are demonstrated.“*” indicates different aa at the site.Lines under peptide of strains 648A and GA represent the predicted secondary structures of gI proteins,the top 3rd line indicates the meanings of “H” “E” “T” “C”，the changed areas in their secondary structures are double-underlined.
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最近几年来，各国科学家都试图用体外试验来鉴别不同致病型的MDV野毒株。比如，用PCR技术已证明，I型MDV在CEF上经多次连续传代后，其基因组上132bp重复片段的拷贝数显著增加[7，8]。但是，在不同致病型的原始野毒间，这一差异并不明显。由于MDV全基因组DNA的测序已接近完成(Lee et al.,个人通讯)，再加上现代重组DNA技术的迅速改进和DNA测序商业化，使扩增、克隆和定序一段DNA变得非常容易，因而有可能用来比较某些基因的DNA变异与其致病型的相关性。鉴于与MDV感染细胞活性密切相关的8个囊膜糖蛋白(gB、C、D、E、G、H、I、K、L)的序列都已发表[3，5，6，9，10，11，12]，使我们对比较不同毒株的糖蛋白基因感兴趣。在目前已知的与抗感染免疫最可能相关的gB、gE和gI三个基因中，已发现gB非常保守，vvMDV的RB1B株[3]、vMDV的GA株(Lee et al.,个人通讯)、疫苗毒CVI988株(彭大新等，待发表资料)和一个毒力很强的澳大利亚株[13]的gB基因DNA序列居然完全一致。然而gI基因却易发生变化[5，6]，因此本研究从gI着手。
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本研究选用来扩增和测定gI基因DNA序列的648A株MDV是特超强毒MDV中毒力指数最高的一株[2]，容易发现它与其它致病型之间的差别。结果表明，648A株的gI基因的DNA序列与已部分完成并发表的超强毒RB1B株的5′端的761个碱基完全相同，而648A株的gI全基因组DNA则与强毒GA株有8个碱基变异，并引起7个氨基酸突变。虽然PCR可能会造成人为的突变，本研究也只对选定的一个克隆测序，但由于648A株和GA株之间的差别仅发生在第667碱基及其上游的5′端，而648A株的第761碱基以前的5′端与RB1B株的761个碱基完全相同，这表明648A株与GA株间的差别确是原648A株病毒固有的，不是在PCR过程中产生的人为突变。
用SEQAID程序对648A和GA株gI序列的分析发现，其中有些氨基酸的变化可能导致亲疏水性及与蛋白质二级结构相关特性的变化。当然，这一结构变化与病毒致病性的关系还有待分析更多的毒株。但根据本研究对vMDV\,vvMDV和vv+MDV三个不同致病型毒株的比较分析，至少已初步表明，MDV的gI的变异主要发生在其5′端，因而，对gI的序列比较只要对其ORF的5′端的700个以内的碱基测序。此外，这一DNA序列比较可将vMDV与毒力更强的毒株区别开来，但要区别vvMDV和vv+MDV，还须选择其它基因进行分析比较。鉴于我国目前还没能按Witter[2]的标准来鉴定国内MDV流行毒株的致病型，本研究结果至少可为将vMDV型毒株与更强毒力的vvMDV和vv+MDV型的区别提供参考数据。
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利用从强毒型GA株MDV克隆到的糖蛋白gB、gE和gI基因作为目的基因，日本Neponzeon公司与美国农业部禽病和肿瘤学研究所联合研制开发了以禽痘病毒为载体的基因工程疫苗，据称其对MD的免疫保护效果要高于单一表达gB的重组FPV(Lee等，个人通讯)。本研究表明，来自特超强毒株648A的gI蛋白质成分中有7个氨基酸不同于强毒GA株，SEQAID程序分析也表明这可能在抗原性上造成差别(文中未列出)。因此，以648A株的gI基因作为目的基因进一步研制出的基因工程疫苗，将有可能对超强毒及特超强毒株MDV感染产生更有效的免疫保护作用。
国家“863”项目及国家自然科学基金资助项目的一部分
崔治中(1944年-),男,江苏江阴市人,博士、教授.主要研究方向为兽医微生物和动物病毒分子生物学.
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1999-05-04, 百拇医药