1型糖尿病患者谷氨酸脱羧酶反应性T淋巴细胞的测定
作者：何君钦 许建瑜 林丽香
单位：福建省立医院内科,福州 350001
关键词：糖尿病；谷氨酸脱羧酶；T淋巴细胞
福建医科大学学报000216
摘要:目的 探讨糖尿病患者血清中谷氨酸脱羧酶反应性T淋巴细胞的阳性反应及临床意义。方法 应用对硝基苯2酰氨基已糖(NAG)微量酶反应比色法反映细胞增殖，检测37例1型糖尿病(DM)患者外周血单核细胞对谷氨酸脱羧酶(GAD)的反应性，并以2型DM、其他自身免疫性疾病患者及正常人各30例作对照。结果 1型DM GAD反应性T淋巴细胞的阳性率为35.1%(13/30),其他自身免疫性疾病10%(3/30)，而2型DM和正常对照组无一例阳性；1型DM阳性率高于对照组(P<0.01)。新发病的1型DM(病程≤1年)阳性率为61.1%(11/18)，长病程(1.5～20年)1型DM的阳性率为10.5%，1型、2型DM差异有显著性(P<0.05)。结论 新发病1型DM存在GAD反应性T淋巴细胞，其检测有益于1型DM的早期诊断。
, 百拇医药
中图分类号:R587.1;R977.3;R977.15 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)02-0144-03
Glutamic Acid Decarboxylase-reaetive T Cells in Type 1 Diabetes Mellitus
HE Jun-qin,XU Jian-yu,LIN Li-xiang
(Department of Endocrinology,Fujian Provincial Hospital,Fuzhou 350001,China)
ABSTRACT:Objective To investigate the glutamic acid decarboxylase-reactive T cells in diabetes mellitus(DM).Methods The proliferative responses to glutamic acid decarboxylase(GAD) of peripheral blood mononuclear cells was measured in patients with type 1 DM,type 2 DM,other autoimmune disease and healthy controls.Results The prevalence of GAD-reactive T cells was 36.7%(11/30) of type 1 DM,10%(3/30) of other autoimmune disease and none of 30 type 2 DM and 30 healthy controls.Very significant difference was observed between type 1 DM and healthy controls(P<0.01).The prevalence of GAD-reactive T cells in newly diagnosed type 1 DM was 62.5%(10/16) (duration <1 year).But only 7.1%(1/14) of type 1 DM of longer duration(1.5～20 year) responded to GAD.Conclusion GAD-reactive T cells will be of value in the diagnosis,treatment and elucidation of mechanism of diabetes mellitus.
, 百拇医药
KEY WORDS:diabetes mellitus;glutamic acid decarboxylase;T lymphocyte cell
1型糖尿病(DM)是一种由T淋巴细胞介导破坏胰岛B细胞引起的自身免疫性疾病。近来研究表明，谷氨酸脱羧酶(GAD)为1型DM的关键性抗原[1]，GAD抗体作为1型DM的预测及DM的分型具有重要价值[2，3]。1型DM在病理上浸润胰岛的最主要细胞是T淋巴细胞，在发病机理上起重要作用。笔者于1994年7月～1995年6月应用基因重组的GAD作为胰岛细胞抗原，测定1型DM患者外周单个核细胞(PBMC)对GAD增殖的阳性率，并讨论其意义。
1 材料与方法
1.1 对象 根据WHO糖尿病诊断标准确诊，根据发病年龄、病史、治疗反应及C肽释放试验区分为：1型DM组37例,男性24例，女性13例,年龄30.4±15.2岁(1.5～37岁),病程3.7±4.8年(10天～20年)。其中病程≤1年16例,男性10例,女性6例；1.5～20年14例，男性8例，女性6例。2型DM组30例，男性13例，女性17例，年龄55.4±11.1岁(41～67岁)，病程5.4±5.2年(2个月～18年)。
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其他自身免疫性疾病30例,包括Graves病21例，系统性红斑狼疮6例，桥本氏甲状腺炎3例;男性4例，女性26例，年龄36.5±11.6岁(17～37岁)，病程3.5±2.8年。所有病例均排除糖尿病家族史，均经临床及实验检查确诊。对照组血清取自健康献血员30例，男性18例，女性12例，年龄35.0±6.7岁(27～45岁)，排除糖尿病和其他自身免疫性疾病家族史。
1.2 方法 收集空腹时血清,用对硝基苯二酰氨基已糖(NAG)微量酶反应比色法检测细胞增殖[4]：Ficoll-Paque淋巴细胞分离液(瑞典Pharmacia Biotech产品)梯度离心法分离PBMC，用含10%灭活的AB血型阳性人血清、10-5mol二硫基乙醇、105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素、20 mmol/L Hepes和3% L-谷氨酰胺的RPMI 1640(Gibco产品)稀释成淋巴细胞数为2×106/ml，加入96孔平底培养板(Linbro产品)100 μl/孔。再分别加入含以下成分的试剂(100 μl/孔,每种设3个复孔)：1640，终浓度20 μg/ml,10 μg/ml(最适浓度)；5 μg/ml的重组人L-GAD纯品(EC 4.1,1.15，Sigma产品)；10 μg/ml牛血清白蛋白(BSA,BMB产品)；l μg/ml植物血凝素(PHA，广州医药工业研究所产品)；5 μg/ml刀豆蛋白A(ConA，Sigma产品)。后置于37℃ CO2培养箱(Mco 175型，Sanyo产品)中，GAD、BSA培养7天，ConA、PHA培养3天；培养结束前4 h，2000 r/min离心10 min，弃去培养液，加PBS洗涤两次，加入含等量0.5%Triton X-100水溶液的0.1 mmo/L枸橼酸缓冲液配制的7.5 mmol/L NAG(Sigma产品)，60 μl/孔,置37°C水浴箱中温育4 h，加含5 mmol/L EDTA的50 mmol/L甘氨酸缓冲液终止反应，90 μl/孔，置全自动酶标仪(EL 311型，Bio-Tek产品)上测OD405值。
, 百拇医药
刺激指数(SI)＝OD抗原/OD1640
1.3 统计学处理 所有数据以
±s表示，采用非配对两组间χ2检验。
2 结 果
对照组对GAD的SI为1.20±0.41，1型DM组为1.95±1.58，2型DM组为1.15±0.43，其他自身免疫性疾病组为1.21±0.69。SI大于对照+3s，即SI≥2.43定为阳性。
2.1 各组GAD反应性T淋巴细胞阳性率(表1)
表1 各组GAD反应性T淋巴细胞阳性率的比较 分 组
n
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阳性(%)
对照组
30
0(0)
DM
1型
37
13(35.1)*
2型
30
0(0)
其他自身免疫性疾病
30
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3(10)#
与对照组比较，*：P<0.01,与1型、2型DM比较，#：P<0.05.2.2 1型DM不同病程GAD反应性T淋巴细胞阳性率(表2)
表2 1型DM GAD反应性淋巴细胞阳性率的比较 病 程
n
阳性(%)
10天～1年
18
11(61.1)*
1.5～20.0年
19
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2(10.5)
合 计
37
11(36.7)
与长病程比较，*：P<0.01.
3 讨 论
NAG微量酶反应比色法能检测多种活细胞的数目及功能状态，且敏感稳定，简便实用[4]。笔者应用基因重组的GAD纯品作为胰岛细胞的关键性抗原，检测各组GAD反应性T淋巴细胞，结果1型DM阳性率为35.1%，1年内发病阳性率为61.1%，这与国外学者报道的67%大致相符[5]，其他自身免疫性疾病阳性率为10.0%，与对照组比较P>0.05;2型DM及对照组中无一例阳性。1型与2型DM的差异有显著性(P<0.05)，说明有助于DM分型。4个实验组对PHA和Con A的增殖反应相同，说明1型DM的T细胞对GAD的反应是特异的。笔者同时检测PBMC对BSA的反应，结果1型DM无一例对其反应，这说明相对于GAD、BSA不是1型DM的主要抗原。近来大量研究表明，牛奶和糖尿病存在相关性[6]。但BSA抗体在1型DM诊断后就很快降低，而GAD抗体在1型DM发病后十几年仍可观察到[3]。
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笔者的结果还表明，发病1年内的1型DM患者GAD反应T淋巴细胞的阳性率明显高于长病程者，后者与对照组差异无显著性，说明GAD反应性T淋巴细胞的检测有益于1型DM的早期诊断。Harrison[7]等发现，在临床前期的1型DM中，低浓度的GAD抗体伴有T细胞对重组GAD的高反应，两者负相关，表明GAD反应性T淋巴细胞在预测1型DM方面可能优于GAD抗体，检测GAD反应性T淋巴细胞有助于加深对GAD自身抗原的认识,有助于阐明1型DM的发病机理,对治疗及干预1型DM具有指导意义。
基金项目:福建省自然科学基金资助项目(C94007)
作者简介:何君钦(1966～)，女，主治医师，医学硕士.
参考文献:
[1]Tisch R,Yang XD,Singer SM,et al.Immune response correlates with insulin in non-obese diabetic mice[J].Nature,1993,366:72.
, http://www.100md.com
[2]Henry T,DeAizpurua HJ,Harrison HC,et al.An ELISA for antibodies to recombinant glutamic acid decarboxylase in IDDM[J].Diabetes,1992,41:1182.
[3]杨文英,征革凡,潘孝仁.谷氨酸脱羧酶抗体对儿童和成人IDDM的诊断意义[J].中华内分泌代谢杂志，1995,11：88.
[4]倪 健，叶天星，杨嗣坤.检测淋巴因子的新方法—NAG微量酶反应比色法[J].上海免疫学杂志，1988,8：47.
[5]Atkinson MA,Kaufman DL,Campbell H,et al.Response of peripheral-blood mononuclear cells to glutamate decarboxylase in insulin-dependent diabetes[J].Lancet,1992,339:458.
, 百拇医药
[6]Karjalainen J,Martin JM,Knip M,et al.A bovine albumin peptide as a possible trigger of insulin-dependent diabetes mellitus[J].N Engl J Med,1992,32:302.
[7]Harrison LC,Honeyman MC,DeAizpurua HJ,et al.Inverse relation between humoral and cellular immunity to glutamic acid decarboxylase in subjects at risk of insulin-dependent diabetes[J].Lancet,1993,31:1365.
收稿日期:2000-03-30, 百拇医药
单位：福建省立医院内科,福州 350001
关键词：糖尿病；谷氨酸脱羧酶；T淋巴细胞
福建医科大学学报000216
摘要:目的 探讨糖尿病患者血清中谷氨酸脱羧酶反应性T淋巴细胞的阳性反应及临床意义。方法 应用对硝基苯2酰氨基已糖(NAG)微量酶反应比色法反映细胞增殖，检测37例1型糖尿病(DM)患者外周血单核细胞对谷氨酸脱羧酶(GAD)的反应性，并以2型DM、其他自身免疫性疾病患者及正常人各30例作对照。结果 1型DM GAD反应性T淋巴细胞的阳性率为35.1%(13/30),其他自身免疫性疾病10%(3/30)，而2型DM和正常对照组无一例阳性；1型DM阳性率高于对照组(P<0.01)。新发病的1型DM(病程≤1年)阳性率为61.1%(11/18)，长病程(1.5～20年)1型DM的阳性率为10.5%，1型、2型DM差异有显著性(P<0.05)。结论 新发病1型DM存在GAD反应性T淋巴细胞，其检测有益于1型DM的早期诊断。
, 百拇医药
中图分类号:R587.1;R977.3;R977.15 文献标识码:A
文章编号:1000-2235(2000)02-0144-03
Glutamic Acid Decarboxylase-reaetive T Cells in Type 1 Diabetes Mellitus
HE Jun-qin,XU Jian-yu,LIN Li-xiang
(Department of Endocrinology,Fujian Provincial Hospital,Fuzhou 350001,China)
ABSTRACT:Objective To investigate the glutamic acid decarboxylase-reactive T cells in diabetes mellitus(DM).Methods The proliferative responses to glutamic acid decarboxylase(GAD) of peripheral blood mononuclear cells was measured in patients with type 1 DM,type 2 DM,other autoimmune disease and healthy controls.Results The prevalence of GAD-reactive T cells was 36.7%(11/30) of type 1 DM,10%(3/30) of other autoimmune disease and none of 30 type 2 DM and 30 healthy controls.Very significant difference was observed between type 1 DM and healthy controls(P<0.01).The prevalence of GAD-reactive T cells in newly diagnosed type 1 DM was 62.5%(10/16) (duration <1 year).But only 7.1%(1/14) of type 1 DM of longer duration(1.5～20 year) responded to GAD.Conclusion GAD-reactive T cells will be of value in the diagnosis,treatment and elucidation of mechanism of diabetes mellitus.
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KEY WORDS:diabetes mellitus;glutamic acid decarboxylase;T lymphocyte cell
1型糖尿病(DM)是一种由T淋巴细胞介导破坏胰岛B细胞引起的自身免疫性疾病。近来研究表明，谷氨酸脱羧酶(GAD)为1型DM的关键性抗原[1]，GAD抗体作为1型DM的预测及DM的分型具有重要价值[2，3]。1型DM在病理上浸润胰岛的最主要细胞是T淋巴细胞，在发病机理上起重要作用。笔者于1994年7月～1995年6月应用基因重组的GAD作为胰岛细胞抗原，测定1型DM患者外周单个核细胞(PBMC)对GAD增殖的阳性率，并讨论其意义。
1 材料与方法
1.1 对象 根据WHO糖尿病诊断标准确诊，根据发病年龄、病史、治疗反应及C肽释放试验区分为：1型DM组37例,男性24例，女性13例,年龄30.4±15.2岁(1.5～37岁),病程3.7±4.8年(10天～20年)。其中病程≤1年16例,男性10例,女性6例；1.5～20年14例，男性8例，女性6例。2型DM组30例，男性13例，女性17例，年龄55.4±11.1岁(41～67岁)，病程5.4±5.2年(2个月～18年)。
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其他自身免疫性疾病30例,包括Graves病21例，系统性红斑狼疮6例，桥本氏甲状腺炎3例;男性4例，女性26例，年龄36.5±11.6岁(17～37岁)，病程3.5±2.8年。所有病例均排除糖尿病家族史，均经临床及实验检查确诊。对照组血清取自健康献血员30例，男性18例，女性12例，年龄35.0±6.7岁(27～45岁)，排除糖尿病和其他自身免疫性疾病家族史。
1.2 方法 收集空腹时血清,用对硝基苯二酰氨基已糖(NAG)微量酶反应比色法检测细胞增殖[4]：Ficoll-Paque淋巴细胞分离液(瑞典Pharmacia Biotech产品)梯度离心法分离PBMC，用含10%灭活的AB血型阳性人血清、10-5mol二硫基乙醇、105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素、20 mmol/L Hepes和3% L-谷氨酰胺的RPMI 1640(Gibco产品)稀释成淋巴细胞数为2×106/ml，加入96孔平底培养板(Linbro产品)100 μl/孔。再分别加入含以下成分的试剂(100 μl/孔,每种设3个复孔)：1640，终浓度20 μg/ml,10 μg/ml(最适浓度)；5 μg/ml的重组人L-GAD纯品(EC 4.1,1.15，Sigma产品)；10 μg/ml牛血清白蛋白(BSA,BMB产品)；l μg/ml植物血凝素(PHA，广州医药工业研究所产品)；5 μg/ml刀豆蛋白A(ConA，Sigma产品)。后置于37℃ CO2培养箱(Mco 175型，Sanyo产品)中，GAD、BSA培养7天，ConA、PHA培养3天；培养结束前4 h，2000 r/min离心10 min，弃去培养液，加PBS洗涤两次，加入含等量0.5%Triton X-100水溶液的0.1 mmo/L枸橼酸缓冲液配制的7.5 mmol/L NAG(Sigma产品)，60 μl/孔,置37°C水浴箱中温育4 h，加含5 mmol/L EDTA的50 mmol/L甘氨酸缓冲液终止反应，90 μl/孔，置全自动酶标仪(EL 311型，Bio-Tek产品)上测OD405值。
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刺激指数(SI)＝OD抗原/OD1640
1.3 统计学处理 所有数据以
±s表示，采用非配对两组间χ2检验。2 结 果
对照组对GAD的SI为1.20±0.41，1型DM组为1.95±1.58，2型DM组为1.15±0.43，其他自身免疫性疾病组为1.21±0.69。SI大于对照+3s，即SI≥2.43定为阳性。
2.1 各组GAD反应性T淋巴细胞阳性率(表1)
表1 各组GAD反应性T淋巴细胞阳性率的比较 分 组
n
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阳性(%)
对照组
30
0(0)
DM
1型
37
13(35.1)*
2型
30
0(0)
其他自身免疫性疾病
30
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3(10)#
与对照组比较，*：P<0.01,与1型、2型DM比较，#：P<0.05.2.2 1型DM不同病程GAD反应性T淋巴细胞阳性率(表2)
表2 1型DM GAD反应性淋巴细胞阳性率的比较 病 程
n
阳性(%)
10天～1年
18
11(61.1)*
1.5～20.0年
19
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2(10.5)
合 计
37
11(36.7)
与长病程比较，*：P<0.01.
3 讨 论
NAG微量酶反应比色法能检测多种活细胞的数目及功能状态，且敏感稳定，简便实用[4]。笔者应用基因重组的GAD纯品作为胰岛细胞的关键性抗原，检测各组GAD反应性T淋巴细胞，结果1型DM阳性率为35.1%，1年内发病阳性率为61.1%，这与国外学者报道的67%大致相符[5]，其他自身免疫性疾病阳性率为10.0%，与对照组比较P>0.05;2型DM及对照组中无一例阳性。1型与2型DM的差异有显著性(P<0.05)，说明有助于DM分型。4个实验组对PHA和Con A的增殖反应相同，说明1型DM的T细胞对GAD的反应是特异的。笔者同时检测PBMC对BSA的反应，结果1型DM无一例对其反应，这说明相对于GAD、BSA不是1型DM的主要抗原。近来大量研究表明，牛奶和糖尿病存在相关性[6]。但BSA抗体在1型DM诊断后就很快降低，而GAD抗体在1型DM发病后十几年仍可观察到[3]。
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笔者的结果还表明，发病1年内的1型DM患者GAD反应T淋巴细胞的阳性率明显高于长病程者，后者与对照组差异无显著性，说明GAD反应性T淋巴细胞的检测有益于1型DM的早期诊断。Harrison[7]等发现，在临床前期的1型DM中，低浓度的GAD抗体伴有T细胞对重组GAD的高反应，两者负相关，表明GAD反应性T淋巴细胞在预测1型DM方面可能优于GAD抗体，检测GAD反应性T淋巴细胞有助于加深对GAD自身抗原的认识,有助于阐明1型DM的发病机理,对治疗及干预1型DM具有指导意义。
基金项目:福建省自然科学基金资助项目(C94007)
作者简介:何君钦(1966～)，女，主治医师，医学硕士.
参考文献:
[1]Tisch R,Yang XD,Singer SM,et al.Immune response correlates with insulin in non-obese diabetic mice[J].Nature,1993,366:72.
, http://www.100md.com
[2]Henry T,DeAizpurua HJ,Harrison HC,et al.An ELISA for antibodies to recombinant glutamic acid decarboxylase in IDDM[J].Diabetes,1992,41:1182.
[3]杨文英,征革凡,潘孝仁.谷氨酸脱羧酶抗体对儿童和成人IDDM的诊断意义[J].中华内分泌代谢杂志，1995,11：88.
[4]倪 健，叶天星，杨嗣坤.检测淋巴因子的新方法—NAG微量酶反应比色法[J].上海免疫学杂志，1988,8：47.
[5]Atkinson MA,Kaufman DL,Campbell H,et al.Response of peripheral-blood mononuclear cells to glutamate decarboxylase in insulin-dependent diabetes[J].Lancet,1992,339:458.
, 百拇医药
[6]Karjalainen J,Martin JM,Knip M,et al.A bovine albumin peptide as a possible trigger of insulin-dependent diabetes mellitus[J].N Engl J Med,1992,32:302.
[7]Harrison LC,Honeyman MC,DeAizpurua HJ,et al.Inverse relation between humoral and cellular immunity to glutamic acid decarboxylase in subjects at risk of insulin-dependent diabetes[J].Lancet,1993,31:1365.
收稿日期:2000-03-30, 百拇医药