高效液相色谱法蒸发光散射检测器测定酸枣仁中酸枣仁皂苷A及B的含量
作者：李会军 李萍
单位：李会军 李萍(中国药科大学生药学教研室 南京 210038)
关键词：酸枣仁；高效液相色谱法；蒸发光散射检测器
药物分析杂志000403 摘要 目的：建立酸枣仁中酸枣仁皂苷A及 B的含量测定方法 ，为该药材 提供质量控制标准。方法：应用高效液相色谱法-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)，Allspere ODS-2(250 mm×4.6 mm , 5 μm)色谱柱 ，甲醇-水 -冰醋酸(70∶30∶1)为流动相 ，测定了酸枣仁中酸枣仁皂苷A及B的含量。结果：分析了11批商品药材。酸枣仁皂苷A及B的平均回收率分别为92.4%(RSD=3.8%)和91.8% (RSD=3.9%) 。结论：方法快速简便，重现性良好，可用于酸枣仁药材的质量控制 。
Determination of Jujuboside A and Jujuboside B
, 百拇医药
in Spine Date Seed by HPLC-ELSD
Li Huijun and Li Ping
(College of Chinese Meteria Medica, China Pharmaceutical University, Nanjing 210038)
Abstract Objective：To develop a method to determine the contents of jujuboside A and jujuboside B in Spine Date Seed so as to evaluate the quality of this herb drug.Methods:With the use of Evaporative Light Scattering Detector (ELSD), an Allspere ODS-2 (250 mm×4.6 mm , 5 μm ) column as analytical column and methanol-water-glacial acetic acid ( 70∶30∶1 ) as mobile phase, the quantities of jujuboside A and jujuboside B in Spine Date Seed were measured.Results:11 commercial crude drugs were analyzed. The mean recoveries of jujuboside A and jujuboside B were 92.4%(RSD=3.8%) and 91.8% (RSD=3.9%), respectively.Conclusion:This method is fast , simple and reproducible and can be used for the quality control of this Chinese herbal medicine.
, 百拇医药
Key words Spine Date Seed , HPLC , ELSD
酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba var. spinosa (Bunge)Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟种子,具有养心安神的功效，是较为常用的镇静催眠中药。酸枣仁皂苷A及B为其镇静催眠的有效成分之一[1]，含量测定方法报道的有一阶导数光谱法[2]及薄层扫描法[3]，本文首次采用高效液相色谱法利用蒸发光散射检测器(ELSD)对酸枣仁皂苷A及B进行了含量测定研究。实验结果表明该法灵敏度、稳定性和重现性均能满足要求，是一种检测皂苷类成分的有效方法。
1 仪器与试剂
日本岛津LC-10AD液相色谱仪；法国SEDEX55型蒸发光散射检测器；HS色谱数据工作站(杭州英谱科技开发有限公司)；各地酸枣仁药材样品(见表1)均经作者鉴定；酸枣仁皂苷A及B对照品由中国药品生物制品检定所提供，纯度≥98.5% ；试验用水为上海获特满公司产纯净水 ；甲醇为淮阴化学试剂厂产色谱纯 ； 其它试剂均为南京化学试剂厂产分析纯。
, 百拇医药
2 色谱及检测条件
色谱柱：Allspere ODS-2(250 mm×4.6 mm , 5 μm) ; 预柱： Pellicular C18 (7.5 mm×4.6 mm); 流动相：甲醇-水-冰醋酸(70∶30∶1); 流速：1mL。min-1。柱温：20 ℃ ；ELSD气化室温度：75 ℃；氮气压力：0.21 MPa 。
3 溶液的制备
对照品溶液的制备：分别精密称取对照品酸枣仁皂苷A 4.092 mg及 B 1.492 mg ，用甲醇溶解并定容至5 mL容量瓶，摇匀，即得。
供试品溶液的制备：按文献[2]的提取纯化方法，精密称取干燥细粉(40目筛)约5 g ，置索氏提取器中用乙醚脱脂4 h ，弃去乙醚液，药渣挥尽醚液，用甲醇回流提取12 h，甲醇液蒸干，残渣用15 mL水溶解并转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取3 次，每次10 mL，合并正丁醇层，再用正丁醇饱和的氨水洗涤2次，每次10 mL，正丁醇层蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至5 mL ，即得 ，临用前取部分溶液经Millipore溶剂过滤系统过滤后进样。
, 百拇医药
4 线性关系考察
精密量取对照品溶液2，4，6，8，10，12 μL，分别进样，按色谱测定条件，测得酸枣仁皂苷A及B的峰面积，用最小二乘法以进样量X(μg)对峰面积对数(logY)进行线性回归，回归方程分别为：
logY=5.197X- 5.264 r=0.999 4
logY=5.073X- 5.187 r=0.999 1
线性范围分别为1.6～9.6 μg 和0.6～3.6 μg。
5 稳定性试验
取酸枣仁药材供试品溶液，进行稳定性试验，测定结果表明在24 h之内稳定。
6 精密度试验
, 百拇医药
取上述对照品溶液5 μL连续进样6次，测得各次峰面积，计算RSD，酸枣仁皂苷A及B的RSD分别为1.0% 和2.7%
7 重复性试验
取同一批样品精密称取5份，按上述测定方法，进行5次平行实验测得酸枣仁皂苷A及B平均含量分别为0.080 3%和0.034 2%，酸枣仁皂苷A及B的RSD分别为3.4% 和3.6%。
8 回收率试验
精密称取已测知含量的酸枣仁药材样品约2.5 g，定量加入上述对照品溶液2.5 mL , 按上述方法制备溶液、测定、计算，酸枣仁皂苷A及B的平均回收率分别为92.4%和91.8%, RSD分别为3.8%和3.9%, n=3。
9 样品测定
取酸枣仁药材供试品溶液在上述色谱条件下进样，每次5 μL或10 μL，按外标两点法对数方程计算 ，所得结果见表1 ，对照品和样品色谱图见图1 。
, 百拇医药
表1 样品测定结果(n=3) 产地
含量/%
酸枣仁皂苷A
酸枣仁皂苷B
河北安国(生)
0.0803
0.0335
河北安国(生)
0.0597
0.0368
山东泰安(生)
0.0753
, 百拇医药
0.0301
山东济南(生)
0.0662
0.0447
山东济南(炒)
0.0828
0.0511
河北 (生)
0.0643
0.0251
山东临沂(炒)
0.0599
, 百拇医药
0.0413
山东临沂(生)
0.0567
0.0415
山东枣庄(炒)
0.0620
0.0456
山东枣庄(生)
0.0396
0.0324
山东济南(生)
0.0467
, 百拇医药
0.0374
图1 高效液相色谱分离图
A.对照品 B.供试品
1.酸枣仁皂苷A 2.酸枣仁皂苷B
10 讨论
10.1 酸枣仁中所含的酸枣仁皂苷A及B为三萜皂苷类成分，紫外吸收差，不宜用UV检测，而ELSD检测器为质量型通用检测器，可检测任何挥发性低于流动相的化合物，且化合物的响应值接近，因而峰面积比例亦近乎各组分的质量之比，同时灵敏度及稳定性亦能符合含量测定的要求,正逐步成为分析无紫外吸收类成分的有力工具[4]。
10.2 雾化器气体压力(载气流速)及漂移管温度是ELSD检测器的2个重要可调参数[5]。载气流速太低，会产生大量微滴，从而导致噪音信号；而载气流速太高时雾滴量下降导致信号降低。温度过高，分析样品部分挥发导致检测器响应下降；温度降低，溶剂挥发不够完全而导致基线不稳。实验中需反复、仔细调节参数以便得到最优信噪比及平稳基线。
, http://www.100md.com
10.3 曾对甲醇-水(80∶20)、甲醇-水(70∶30)等不同流动相进行研究，结果发现甲醇-水-冰醋酸(70∶30∶1)能得到较好的对称峰和分离度。含量测定结果表明，酸枣仁药材各主产区样品中酸枣仁皂苷A及B含量有一定差异，且炒枣仁中含量普遍高于生枣仁，这与文献[3]报道一致。
参考文献
1，Watanabd I, Saito H, Takagi K. Pharmacological studies of Zizyphus seeds. Japan J Pharmacol, 1973 ，23(4) : 563
2，展雪峰. 一阶导数紫外分光光度法测定酸枣仁中酸枣仁皂甙A的含量. 中草药，1993，24(10): 525
3，王健，林晓. 生炒酸枣仁中酸枣仁皂甙A和B的含量比较. 中成药，1994, 16 (10): 24
4，田南卉, 王颉 , 厉进忠 . 高效液相色谱法蒸发光散射检测器测定银杏叶提取物中内酯的含量. 药物分析杂志 ，1997 ，17(4) : 282
5，冯埃生 , 邹汉法，汪海林等. 影响高效液相色谱/挥发激光散射检测器检测性能基本因素的考察. 药物分析杂志 , 1996 , 16(6) : 414
(本文于1999年5月14日收到), 百拇医药
单位：李会军 李萍(中国药科大学生药学教研室 南京 210038)
关键词：酸枣仁；高效液相色谱法；蒸发光散射检测器
药物分析杂志000403 摘要 目的：建立酸枣仁中酸枣仁皂苷A及 B的含量测定方法 ，为该药材 提供质量控制标准。方法：应用高效液相色谱法-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)，Allspere ODS-2(250 mm×4.6 mm , 5 μm)色谱柱 ，甲醇-水 -冰醋酸(70∶30∶1)为流动相 ，测定了酸枣仁中酸枣仁皂苷A及B的含量。结果：分析了11批商品药材。酸枣仁皂苷A及B的平均回收率分别为92.4%(RSD=3.8%)和91.8% (RSD=3.9%) 。结论：方法快速简便，重现性良好，可用于酸枣仁药材的质量控制 。
Determination of Jujuboside A and Jujuboside B
, 百拇医药
in Spine Date Seed by HPLC-ELSD
Li Huijun and Li Ping
(College of Chinese Meteria Medica, China Pharmaceutical University, Nanjing 210038)
Abstract Objective：To develop a method to determine the contents of jujuboside A and jujuboside B in Spine Date Seed so as to evaluate the quality of this herb drug.Methods:With the use of Evaporative Light Scattering Detector (ELSD), an Allspere ODS-2 (250 mm×4.6 mm , 5 μm ) column as analytical column and methanol-water-glacial acetic acid ( 70∶30∶1 ) as mobile phase, the quantities of jujuboside A and jujuboside B in Spine Date Seed were measured.Results:11 commercial crude drugs were analyzed. The mean recoveries of jujuboside A and jujuboside B were 92.4%(RSD=3.8%) and 91.8% (RSD=3.9%), respectively.Conclusion:This method is fast , simple and reproducible and can be used for the quality control of this Chinese herbal medicine.
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Key words Spine Date Seed , HPLC , ELSD
酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba var. spinosa (Bunge)Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟种子,具有养心安神的功效，是较为常用的镇静催眠中药。酸枣仁皂苷A及B为其镇静催眠的有效成分之一[1]，含量测定方法报道的有一阶导数光谱法[2]及薄层扫描法[3]，本文首次采用高效液相色谱法利用蒸发光散射检测器(ELSD)对酸枣仁皂苷A及B进行了含量测定研究。实验结果表明该法灵敏度、稳定性和重现性均能满足要求，是一种检测皂苷类成分的有效方法。
1 仪器与试剂
日本岛津LC-10AD液相色谱仪；法国SEDEX55型蒸发光散射检测器；HS色谱数据工作站(杭州英谱科技开发有限公司)；各地酸枣仁药材样品(见表1)均经作者鉴定；酸枣仁皂苷A及B对照品由中国药品生物制品检定所提供，纯度≥98.5% ；试验用水为上海获特满公司产纯净水 ；甲醇为淮阴化学试剂厂产色谱纯 ； 其它试剂均为南京化学试剂厂产分析纯。
, 百拇医药
2 色谱及检测条件
色谱柱：Allspere ODS-2(250 mm×4.6 mm , 5 μm) ; 预柱： Pellicular C18 (7.5 mm×4.6 mm); 流动相：甲醇-水-冰醋酸(70∶30∶1); 流速：1mL。min-1。柱温：20 ℃ ；ELSD气化室温度：75 ℃；氮气压力：0.21 MPa 。
3 溶液的制备
对照品溶液的制备：分别精密称取对照品酸枣仁皂苷A 4.092 mg及 B 1.492 mg ，用甲醇溶解并定容至5 mL容量瓶，摇匀，即得。
供试品溶液的制备：按文献[2]的提取纯化方法，精密称取干燥细粉(40目筛)约5 g ，置索氏提取器中用乙醚脱脂4 h ，弃去乙醚液，药渣挥尽醚液，用甲醇回流提取12 h，甲醇液蒸干，残渣用15 mL水溶解并转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取3 次，每次10 mL，合并正丁醇层，再用正丁醇饱和的氨水洗涤2次，每次10 mL，正丁醇层蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至5 mL ，即得 ，临用前取部分溶液经Millipore溶剂过滤系统过滤后进样。
, 百拇医药
4 线性关系考察
精密量取对照品溶液2，4，6，8，10，12 μL，分别进样，按色谱测定条件，测得酸枣仁皂苷A及B的峰面积，用最小二乘法以进样量X(μg)对峰面积对数(logY)进行线性回归，回归方程分别为：
logY=5.197X- 5.264 r=0.999 4
logY=5.073X- 5.187 r=0.999 1
线性范围分别为1.6～9.6 μg 和0.6～3.6 μg。
5 稳定性试验
取酸枣仁药材供试品溶液，进行稳定性试验，测定结果表明在24 h之内稳定。
6 精密度试验
, 百拇医药
取上述对照品溶液5 μL连续进样6次，测得各次峰面积，计算RSD，酸枣仁皂苷A及B的RSD分别为1.0% 和2.7%
7 重复性试验
取同一批样品精密称取5份，按上述测定方法，进行5次平行实验测得酸枣仁皂苷A及B平均含量分别为0.080 3%和0.034 2%，酸枣仁皂苷A及B的RSD分别为3.4% 和3.6%。
8 回收率试验
精密称取已测知含量的酸枣仁药材样品约2.5 g，定量加入上述对照品溶液2.5 mL , 按上述方法制备溶液、测定、计算，酸枣仁皂苷A及B的平均回收率分别为92.4%和91.8%, RSD分别为3.8%和3.9%, n=3。
9 样品测定
取酸枣仁药材供试品溶液在上述色谱条件下进样，每次5 μL或10 μL，按外标两点法对数方程计算 ，所得结果见表1 ，对照品和样品色谱图见图1 。
, 百拇医药
表1 样品测定结果(n=3) 产地
含量/%
酸枣仁皂苷A
酸枣仁皂苷B
河北安国(生)
0.0803
0.0335
河北安国(生)
0.0597
0.0368
山东泰安(生)
0.0753
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0.0301
山东济南(生)
0.0662
0.0447
山东济南(炒)
0.0828
0.0511
河北 (生)
0.0643
0.0251
山东临沂(炒)
0.0599
, 百拇医药
0.0413
山东临沂(生)
0.0567
0.0415
山东枣庄(炒)
0.0620
0.0456
山东枣庄(生)
0.0396
0.0324
山东济南(生)
0.0467
, 百拇医药
0.0374
图1 高效液相色谱分离图
A.对照品 B.供试品
1.酸枣仁皂苷A 2.酸枣仁皂苷B
10 讨论
10.1 酸枣仁中所含的酸枣仁皂苷A及B为三萜皂苷类成分，紫外吸收差，不宜用UV检测，而ELSD检测器为质量型通用检测器，可检测任何挥发性低于流动相的化合物，且化合物的响应值接近，因而峰面积比例亦近乎各组分的质量之比，同时灵敏度及稳定性亦能符合含量测定的要求,正逐步成为分析无紫外吸收类成分的有力工具[4]。
10.2 雾化器气体压力(载气流速)及漂移管温度是ELSD检测器的2个重要可调参数[5]。载气流速太低，会产生大量微滴，从而导致噪音信号；而载气流速太高时雾滴量下降导致信号降低。温度过高，分析样品部分挥发导致检测器响应下降；温度降低，溶剂挥发不够完全而导致基线不稳。实验中需反复、仔细调节参数以便得到最优信噪比及平稳基线。
, http://www.100md.com
10.3 曾对甲醇-水(80∶20)、甲醇-水(70∶30)等不同流动相进行研究，结果发现甲醇-水-冰醋酸(70∶30∶1)能得到较好的对称峰和分离度。含量测定结果表明，酸枣仁药材各主产区样品中酸枣仁皂苷A及B含量有一定差异，且炒枣仁中含量普遍高于生枣仁，这与文献[3]报道一致。
参考文献
1，Watanabd I, Saito H, Takagi K. Pharmacological studies of Zizyphus seeds. Japan J Pharmacol, 1973 ，23(4) : 563
2，展雪峰. 一阶导数紫外分光光度法测定酸枣仁中酸枣仁皂甙A的含量. 中草药，1993，24(10): 525
3，王健，林晓. 生炒酸枣仁中酸枣仁皂甙A和B的含量比较. 中成药，1994, 16 (10): 24
4，田南卉, 王颉 , 厉进忠 . 高效液相色谱法蒸发光散射检测器测定银杏叶提取物中内酯的含量. 药物分析杂志 ，1997 ，17(4) : 282
5，冯埃生 , 邹汉法，汪海林等. 影响高效液相色谱/挥发激光散射检测器检测性能基本因素的考察. 药物分析杂志 , 1996 , 16(6) : 414
(本文于1999年5月14日收到), 百拇医药