高效液相色谱法测定何首乌及制首乌中羟芪衍生物的含量
作者：鲁静 粟晓黎 董海荣 李民生
单位：鲁静 粟晓黎(中国药品生物制品检定所 北京 100050)；董海荣(承德中药厂 河北 067000)；李民生(山西省药品检验所 太原 030001)
关键词：何首乌 2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷；高效液相色谱法
药物分析杂志000211摘要 目的：建立中药何首乌专属性成分的测定方法。方法：应用低压柱色谱法，从中分离得到羟芪衍生物—2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，并以此对照建立了测定方法。结果：采用C18色谱柱，25%乙腈为流动相，320 nm检测。线性关系考察，回归方程为：Y=1 024.04+1 588 084.61X，r=0.999 9。加样回收率平均值为99.76%，RSD=1.22%(n=5)。结论：本法简便、灵敏、专属性强，为何首乌及制首乌的质量评价提供了有效的方法。
, http://www.100md.com
HPLC Determination of Stilbene Derivative in Radix Polygoni Multiflori
Lu Jing and Su Xiaoli
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050)
Dong Hairong
(Chengde Factory of Traditional Chinese Materia Medica,Hebei 067000)
Li Minsheng
(Shanxi Province Institute of Drug Control,Taiyuan 030001)
, http://www.100md.com
Abstract Objective：A stilbene derivative,2,3,5,4′-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside was separated from Radix Polygoni Multiflori by vacuum chromatographic method.And then the HPLC method for determining the content in crude drug was set up.Method:Using octadecyl silyl bonded silica gel as the stationary phase and 25% acetonitrile as mobile phase,with detection at 320 nm.Results:Calibration equation was Y=1 024.04+1 588 084.61X,r=0.999 9.The recovery was 99.76%，RSD=1.22%(n=5).Conclusion:This method is simple,specific,and provides an efficient method for the quality evaluation of Radix Polygoni Multiflori and its preparation.
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Key words Radix Polygoni Multiflori,2,3,5,4′-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside,HPLC
何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)为常用中药，药用历史悠久。在中医临床，生首乌解毒、消痈，润肠通便；制首乌补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨[1]。现代药理研究证明其具有抗衰老、降血脂等多种药理活性，临床用于防治衰老及动脉粥样硬化、高血压、慢性气管炎、糖尿病、神经衰弱等中老年疾病[2]。
何首乌含有的化学成分主要有蒽醌类、羟芪衍生物及磷脂类等。以往中成药质量标准中大多以蒽醌类作为含量指标。由于其含有的蒽醌类成分，如大黄素、大黄酚等在同属大黄、虎杖等药材中也含有，因此作为指标成分专属性较差。
在何首乌质量标准研究中，我们分离、鉴定了其中含量较高的羟芪类成分—2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。据文献报道[2]该成分为抗衰老、降血脂药理药效的活性成分，且为何首乌的特征成分。为此，进一步建立了高效液相色谱法测定2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的方法，并测定了生首乌和制首乌商品药材，为首乌药材的质量评价提供了一新的指标和方法。
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1 仪器和试药
高效液相色谱仪(日本岛津)：LC-10AD泵；SPD-M10A二极管阵列检测器；CLASS-10A色谱工作站。
试剂：乙腈为色谱纯，乙醇、甲醇等为分析纯。
药材：生首乌、制首乌药材由本所及湖南、浙江、广西、云南、四川、河南、广东等省药品检验所协助采集或收购。经本所中药标本馆张继主管药师鉴定。
对照品：自行提取、分离制备，经UV、IR、NMR光谱测定，数据与文献[3]一致。高效液相色谱归一化法纯度大于98.0%。
2 色谱条件
色谱柱：Platinum(Alltech)C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；流动相：25%乙腈，1 min。mL-1检测波长：320 nm。进样量10 μL。
, 百拇医药
3 供试品溶液的制备
取本品粉末(过4号筛)0.2 g，精密称定，精密加入50%乙醇25 mL，水浴加热回流30 min，放冷，补足失重，上清液以0.45 μm滤膜滤过，即得。按上述色谱条件测定的色谱图见图1。
图1 样品色谱分离情况
a.2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷
4 方法学考察
4.1 线性关系考察 取对照品适量，精密称定，加50%乙醇溶解并稀释制成0.45 mg。mL-1对照品溶液。取2，4，6，8，10 μL进样，以上述色谱条件测定峰面积值，结果以进样量为横坐标(X)，以峰面积值为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程为：
, 百拇医药
Y=1 024.04+1 588 084.61X r=0.999 9
结果显示：在0.90～4.50 μg范围，对照品量与色谱峰面积值呈良好线性关系。
4.2 色谱峰峰纯度和光谱一致性测定 以上述提取方法及色谱条件得到的结果，供试品溶液中与对照品相应的色谱峰，峰纯度系数为0.999 1；供试品中与对照品相应色谱峰的光谱相似性系数1.000 0。
4.3 最小检出量 将上述对照品溶液稀释至0.001 8 mg。mL-1，进样1 μL(0.001 8 μg)，仍可检出大于基线噪音3倍量的色谱峰。
4.4 重复性测定 取样品5份，按“3.4”项制备供试品溶液，并按上述色谱条件测定含量，结果平均含量为2.38%，RSD为2.28%(n=5)。
, 百拇医药
4.5 回收率测定 取已测知含量(2.38%)的样品0.1 g，精密称定，精密加入对照品溶液(0.122 mg。mL-1)25 mL，照上述方法提取、测定5次，结果平均回收率为99.76%，RSD为1.22%。
5 样品含量测定
应用上述方法，对9份生首乌和7份制首乌样品中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量进行了测定，结果见表1。
表1 样品测定结果 生首乌
制首乌
产地
含量/%
产地
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含量/%
河北安国
6.348
湖北宜昌
5.180
广东
1.777
广东
3.304
浙江
1.086
浙江
0.140
, 百拇医药
广西百色
0.143
广西隆林
1.163
四川
6.852
四川
4.709
河南
3.309
河南
0.392
云南
, http://www.100md.com
0.697
云南
3.070
湖南
5.874
湖南
2.307
6 讨论
6.1 关于流动相系统，曾先后试验了25%，30%，35%，40%甲醇；20%，25%，30%乙腈等，结果以25%乙腈系统，色谱分离的峰纯度最高，与其它成分的色谱峰分离良好。关于检测波长，以二极管阵列检测器测定2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷色谱峰的光谱吸收曲线，其在(320±1) nm有最大吸收，因此选择检测波长为320 nm。
, 百拇医药
6.2 测定用生首乌药材粉碎，分别过2号、4号筛，以上述色谱条件测定含量。结果：过2号筛样品粉末与颗粒不均匀，加之取样量较少，平行测定结果差异较大；而过4号筛样品测定结果均匀性良好。因此，样品需过4号筛后取样测定。
6.3 供试品提取方法，曾先后以甲醇、30%甲醇、25%乙腈、50%乙醇超声提取，结果50%乙醇提取率最高；又以50%乙醇超声提取和加热提取进行比较，结果以加热提取测定结果较高。因此，确定采用50%乙醇加热提取的方法。
6.4 2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷成分对光不稳定，试验中比较了避光与不避光操作对含量测定的影响，结果(表2)表明整个操作应避光进行。
表2 避光与不避光操作的比较(%) 放置时间/h
避光
, 百拇医药 不避光
0
2.294
2.296
4
2.342
2.154
24
2.359
2.030
RSD/%
1.43
6.16
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6.5 对9份生首乌样品的测定结果表明样品中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量差异较大。其中，广西百色、云南2份样品较低。这2份样品，外形上也与传统药材有较大差异(“云锦花纹”不明显，有一明显木心)。据鉴定，与近年药材市场上出现的类似物相似，可能来源于同属或近缘植物，有待深入研究。
6.6 所测的7份制首乌样品，含量差异也较明显。这里有药材来源的因素，也有炮制加工方法的影响。我们拟进一步对制首乌的炮制方法进行考察，以制定合理的限量标准。
参考文献
1，中国药典.1995.一部：149
2，邓文龙，龚世蓉. 何首乌研究进展.中草药，1987，18(3)：42
3，李建北，林茂.何首乌化学成分的研究.中草药，1993，24(3)：115
(本文于1999年1月25日收到), http://www.100md.com
单位：鲁静 粟晓黎(中国药品生物制品检定所 北京 100050)；董海荣(承德中药厂 河北 067000)；李民生(山西省药品检验所 太原 030001)
关键词：何首乌 2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷；高效液相色谱法
药物分析杂志000211摘要 目的：建立中药何首乌专属性成分的测定方法。方法：应用低压柱色谱法，从中分离得到羟芪衍生物—2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，并以此对照建立了测定方法。结果：采用C18色谱柱，25%乙腈为流动相，320 nm检测。线性关系考察，回归方程为：Y=1 024.04+1 588 084.61X，r=0.999 9。加样回收率平均值为99.76%，RSD=1.22%(n=5)。结论：本法简便、灵敏、专属性强，为何首乌及制首乌的质量评价提供了有效的方法。
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HPLC Determination of Stilbene Derivative in Radix Polygoni Multiflori
Lu Jing and Su Xiaoli
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050)
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(Chengde Factory of Traditional Chinese Materia Medica,Hebei 067000)
Li Minsheng
(Shanxi Province Institute of Drug Control,Taiyuan 030001)
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Abstract Objective：A stilbene derivative,2,3,5,4′-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside was separated from Radix Polygoni Multiflori by vacuum chromatographic method.And then the HPLC method for determining the content in crude drug was set up.Method:Using octadecyl silyl bonded silica gel as the stationary phase and 25% acetonitrile as mobile phase,with detection at 320 nm.Results:Calibration equation was Y=1 024.04+1 588 084.61X,r=0.999 9.The recovery was 99.76%，RSD=1.22%(n=5).Conclusion:This method is simple,specific,and provides an efficient method for the quality evaluation of Radix Polygoni Multiflori and its preparation.
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Key words Radix Polygoni Multiflori,2,3,5,4′-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside,HPLC
何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)为常用中药，药用历史悠久。在中医临床，生首乌解毒、消痈，润肠通便；制首乌补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨[1]。现代药理研究证明其具有抗衰老、降血脂等多种药理活性，临床用于防治衰老及动脉粥样硬化、高血压、慢性气管炎、糖尿病、神经衰弱等中老年疾病[2]。
何首乌含有的化学成分主要有蒽醌类、羟芪衍生物及磷脂类等。以往中成药质量标准中大多以蒽醌类作为含量指标。由于其含有的蒽醌类成分，如大黄素、大黄酚等在同属大黄、虎杖等药材中也含有，因此作为指标成分专属性较差。
在何首乌质量标准研究中，我们分离、鉴定了其中含量较高的羟芪类成分—2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。据文献报道[2]该成分为抗衰老、降血脂药理药效的活性成分，且为何首乌的特征成分。为此，进一步建立了高效液相色谱法测定2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的方法，并测定了生首乌和制首乌商品药材，为首乌药材的质量评价提供了一新的指标和方法。
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1 仪器和试药
高效液相色谱仪(日本岛津)：LC-10AD泵；SPD-M10A二极管阵列检测器；CLASS-10A色谱工作站。
试剂：乙腈为色谱纯，乙醇、甲醇等为分析纯。
药材：生首乌、制首乌药材由本所及湖南、浙江、广西、云南、四川、河南、广东等省药品检验所协助采集或收购。经本所中药标本馆张继主管药师鉴定。
对照品：自行提取、分离制备，经UV、IR、NMR光谱测定，数据与文献[3]一致。高效液相色谱归一化法纯度大于98.0%。
2 色谱条件
色谱柱：Platinum(Alltech)C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；流动相：25%乙腈，1 min。mL-1检测波长：320 nm。进样量10 μL。
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3 供试品溶液的制备
取本品粉末(过4号筛)0.2 g，精密称定，精密加入50%乙醇25 mL，水浴加热回流30 min，放冷，补足失重，上清液以0.45 μm滤膜滤过，即得。按上述色谱条件测定的色谱图见图1。
图1 样品色谱分离情况
a.2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷
4 方法学考察
4.1 线性关系考察 取对照品适量，精密称定，加50%乙醇溶解并稀释制成0.45 mg。mL-1对照品溶液。取2，4，6，8，10 μL进样，以上述色谱条件测定峰面积值，结果以进样量为横坐标(X)，以峰面积值为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程为：
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Y=1 024.04+1 588 084.61X r=0.999 9
结果显示：在0.90～4.50 μg范围，对照品量与色谱峰面积值呈良好线性关系。
4.2 色谱峰峰纯度和光谱一致性测定 以上述提取方法及色谱条件得到的结果，供试品溶液中与对照品相应的色谱峰，峰纯度系数为0.999 1；供试品中与对照品相应色谱峰的光谱相似性系数1.000 0。
4.3 最小检出量 将上述对照品溶液稀释至0.001 8 mg。mL-1，进样1 μL(0.001 8 μg)，仍可检出大于基线噪音3倍量的色谱峰。
4.4 重复性测定 取样品5份，按“3.4”项制备供试品溶液，并按上述色谱条件测定含量，结果平均含量为2.38%，RSD为2.28%(n=5)。
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4.5 回收率测定 取已测知含量(2.38%)的样品0.1 g，精密称定，精密加入对照品溶液(0.122 mg。mL-1)25 mL，照上述方法提取、测定5次，结果平均回收率为99.76%，RSD为1.22%。
5 样品含量测定
应用上述方法，对9份生首乌和7份制首乌样品中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量进行了测定，结果见表1。
表1 样品测定结果 生首乌
制首乌
产地
含量/%
产地
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含量/%
河北安国
6.348
湖北宜昌
5.180
广东
1.777
广东
3.304
浙江
1.086
浙江
0.140
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广西百色
0.143
广西隆林
1.163
四川
6.852
四川
4.709
河南
3.309
河南
0.392
云南
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0.697
云南
3.070
湖南
5.874
湖南
2.307
6 讨论
6.1 关于流动相系统，曾先后试验了25%，30%，35%，40%甲醇；20%，25%，30%乙腈等，结果以25%乙腈系统，色谱分离的峰纯度最高，与其它成分的色谱峰分离良好。关于检测波长，以二极管阵列检测器测定2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷色谱峰的光谱吸收曲线，其在(320±1) nm有最大吸收，因此选择检测波长为320 nm。
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6.2 测定用生首乌药材粉碎，分别过2号、4号筛，以上述色谱条件测定含量。结果：过2号筛样品粉末与颗粒不均匀，加之取样量较少，平行测定结果差异较大；而过4号筛样品测定结果均匀性良好。因此，样品需过4号筛后取样测定。
6.3 供试品提取方法，曾先后以甲醇、30%甲醇、25%乙腈、50%乙醇超声提取，结果50%乙醇提取率最高；又以50%乙醇超声提取和加热提取进行比较，结果以加热提取测定结果较高。因此，确定采用50%乙醇加热提取的方法。
6.4 2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷成分对光不稳定，试验中比较了避光与不避光操作对含量测定的影响，结果(表2)表明整个操作应避光进行。
表2 避光与不避光操作的比较(%) 放置时间/h
避光
, 百拇医药 不避光
0
2.294
2.296
4
2.342
2.154
24
2.359
2.030
RSD/%
1.43
6.16
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6.5 对9份生首乌样品的测定结果表明样品中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量差异较大。其中，广西百色、云南2份样品较低。这2份样品，外形上也与传统药材有较大差异(“云锦花纹”不明显，有一明显木心)。据鉴定，与近年药材市场上出现的类似物相似，可能来源于同属或近缘植物，有待深入研究。
6.6 所测的7份制首乌样品，含量差异也较明显。这里有药材来源的因素，也有炮制加工方法的影响。我们拟进一步对制首乌的炮制方法进行考察，以制定合理的限量标准。
参考文献
1，中国药典.1995.一部：149
2，邓文龙，龚世蓉. 何首乌研究进展.中草药，1987，18(3)：42
3，李建北，林茂.何首乌化学成分的研究.中草药，1993，24(3)：115
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