反相高效液相色谱法测定穿琥宁含量
作者：张丹 曾经泽 李猛
单位：张丹 曾经泽(华西医科大学药学院 成都 610041)；李猛(成都市医药职大学生)
关键词：穿琥宁；穿心莲内酯；反相高效液相色谱法
药物分析杂志000111 摘 要：目的：建立反相高效液相色谱法测定穿琥宁及其注射液的含量。方法：采用μBondpak C18色谱柱，甲醇-水(70∶30)为流动相，250 nm为检测波长，室温下对穿琥宁及其注射剂进行含量测定。结果：能将穿琥宁及其主要杂质穿心莲内酯进行分离；穿琥宁在25～400 μg.mL-1范围内，峰面积与其浓度线性关系良好(r=0.999 9)；样品平均回收率为100.6%；日内精密度RSD为1.08%(n=5)，日间(10 d内)精密度RSD为2.06%(n=5)。结论：该法简便、快速、专属性强，可以满足其原料和制剂的质量控制要求。
, http://www.100md.com
Determination of the Content of Potassium
Dehydroandrographolide Succinate by RP-HPLC
Zhang Dan Zeng Jingze Li Meng
(Pharmacy School of West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
Abstract：Objective：To establish a method using RP-HPLC for determination of the content of potassium dehydroandrographolide succinate and its injections.Method:The instrument was LC-3A HPLC with a μBondapak C18 column (25 cm×4.6 mm，10 μm),the mobile phase was methanol-water(70∶30) and the flow rate was 1.0 mL.min-1. The UV detection wavelength was 250 nm and column temperature was room temperature.Results:It can separate the potassium dehydroandrographolide succinate and its primary impurity andrographolide. The calibration curve was linear(r=0.999 9)within the range of 25～400 μg.mL-1 for potassium dehydroandrographolide succinate, the mean recovery was 100.6%， the within-day precision RSD was 1.08%(n=5) and day-to-day precision RSD was 2.06% (n=5) at three drug levels. Conclusion:This method is simple, quick and specific, suitable for the quality control of the drug and its preparation.
, 百拇医药
Key words：potassium dehydroandrographolide succinate, andrographolide, RP-HPLC▲
穿琥宁(脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐，Potassium Dehydroandrographolide Succinate)是一种以穿心莲内酯为原料，经与琥珀酸酐等反应而制得的半合成药物，具有明显的抗炎解热作用，对病毒性肺炎、病毒性上感及急性细菌性痢疾等有较好疗效[1]。穿琥宁的含量测定，目前国内普遍采用分光光度法[2～4]。本文建立的反相高效液相色谱法，能将穿琥宁与有关杂质峰进行有效分离，不仅可测定穿琥宁及其注射剂的含量，而且可作为药物鉴别依据。该法简便、快速、灵敏度高、专属性强，国内外文献尚未见报道。该法适用于穿琥宁及其制剂的生产、贮存及临床应用中的质量控制。
1 仪器与色谱条件
, http://www.100md.com 日本岛津LC-3A液相色谱仪，SPD-1型紫外检测器，C-R1A型色谱数据处理机；美国Rheodyne 7725型液相色谱进样器。
色谱柱：μBondapak C18柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)；流动相：甲醇-水(70∶30)；流速：1.0 mL.min-1；检测波长：250 nm；柱温：室温。
2 药品及试剂
穿琥宁对照品：四川宜宾制药厂提供，含量：99.98%；穿心莲内酯对照品：中国药品生物制品检定所提供；穿琥宁原料及其注射剂：四川宜宾制药厂生产。实验用水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
3 线性范围
精密称取穿琥宁对照品适量，用50%甲醇溶解并稀释成含穿琥宁500 μg.mL-1的贮备液，冰箱内4 ℃保存；精密量取该贮备液适量，用50%甲醇配成含穿琥宁分别为25，50，100，200，300，400 μg.mL-1的标准溶液，各进样20 μL，按色谱条件测定。以穿琥宁峰面积(Y)对标准溶液浓度(X)进行线性回归，得回归方程：
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Y=-25+912.6X r=0.999 9 n=5
线性范围为25～400 μg.mL-1，检测限为0.1 μg(S/N=3)，定量限为25 μg.mL-1。
4 回收率试验
4.1 穿琥宁原料加样回收率试验 精密称取已知含量(99.96%)的穿琥宁原料适量，用50%甲醇溶解并配成一定浓度的溶液，加入不同量的穿琥宁对照品，依法进行回收率试验。5次测定结果平均回收率为100.7%～101.9%，RSD为1.18%。
4.2 穿琥宁注射剂加样回收率试验，精密量取已知标示量含量(90.19%)的穿琥宁注射剂适量，用50%甲醇配成一定浓度的溶液，加入不同量的穿琥宁对照品，依法进行回收率试验，5次测定结果平均回收率为99.35%～100.3%，RSD为1.62%。
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5 精密度试验
精密称取穿琥宁原料适量，用50%甲醇溶解并配成高、中、低3种浓度的溶液，同法测定后代入当日标准曲线求出其含量，考察日内及日间(10 d内)精密度。5次测定结果日内RSD<1.16%，日间RSD<2.54%。
6 样品测定
6.1 原料药含量测定 取样品约15 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取20 μL，注入色谱仪，记录色谱图(图1-A)，量取峰面积，代入当日标准曲线求出穿琥宁含量。结果见表1。
表1 穿琥宁原料含量测定结果(n=5) 批号
样品量/
μg.mL-1
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测得量/
μg.mL-1
含量/
%
RSD/
%
970901
153.2
152.6
98.89
1.17
970902
, 百拇医药
149.0
148.4
98.71
1.47
970903
152.9
152.2
98.76
1.45
971201
153.2
153.2
99.96
, 百拇医药
2.24
6.2 注射剂含量测定 精密量取注射剂(规格：20 mg.mL-1)1 mL，置100 mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取20 μL，注入色谱仪，记录色谱图(图1-B、C)，量取峰面积，代入当日标准曲线求出穿琥宁含量。结果见表2。
图1 穿琥宁样品色谱图
A.穿琥宁原料 B.穿琥宁注射液 C.注射液空白
1.穿琥宁 2.穿心莲内酯
表2 穿琥宁注射液含量测定结果(n=5) 批号
样品量/
, 百拇医药
μg.mL-1
测得量/
μg.mL-1
标示百分含
量/%
RSD
%
970510
200.0
170.6
85.28
1.29
, 百拇医药
970608
200.0
180.4
90.19
1.58
971210
200.0
209.4
104.7
1.59
980301
200.0
219.9
, http://www.100md.com
109.9
1.00
7 讨论
7.1 按中国药典1995年版附录ⅤD规定方法，以穿琥宁峰计算色谱柱的理论塔板数约为1 780，穿琥宁与杂质穿心莲内酯的分离度约为4.3(见图1)。故建议用于穿琥宁含量测定的色谱柱，按穿琥宁峰计算的理论塔板数应不小于1 500，以确保其与溶剂峰及可能存在的杂质的分离度符合要求。
7.2 国内较早曾有采用比色法测定穿琥宁含量的报道[5]。虽然此法对仪器要求不高，操作较简便，但测定结果受试剂浓度、温度、显色时间等诸因素影响较大，故易引入测定误差。
7.3 穿心莲内酯是穿琥宁的主要杂质。产生原因一是由生产过程引入。因穿心莲内酯是合成穿琥宁的前体物质，在合成中有可能反应不够完全而带入成品中；二是在贮存过程中受外界条件影响，自身分解而产生。
, 百拇医药
7.4 穿心莲内酯在穿琥宁测定波长(250 nm)处亦有吸收(图1-A、B)。所以若采用分光光度法测定，穿心莲内酯必然会对测定产生干扰。本文建立的反相高效液相色谱法，具有简便、快速(一次分析少于10 min)、灵敏、专属的特点，能将穿琥宁与穿心莲内酯完全分离，从而保证了测定结果的准确性。
7.5 据试验得知，穿琥宁对照品贮备液在冰箱4℃条件下2个月内浓度基本不变。但其稀释液(标准溶液系列)及样品溶液最好还是临用新配，以防药物在极稀溶液中分解损失。
7.6 由表2可见，市售不同批号的穿琥宁注射液中穿琥宁的含量相差较大，其中生产批号较早的含量较低。说明经过较长时间放置后，药物在溶液中存在分解损失现象。因此在临床应用中应特别注意药物的有效期，另外，对中药注射剂的稳定性研究亦应引起足够的重视。■
参考文献：
[1]邓文龙，聂仁吉，刘家玉等.穿心莲制剂炎宁—3药理作用初步研究.中草药通讯，1978，(8)：26
[2]张志荣，廖工铁，王炳南等.脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐在家兔体内的药代动力学研究.华西药学杂志，1991，6(3)：129
[3]北京市药品标准.1996.158
[4]四川省药品标准.1992.282
[5]邹昭明.脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐含量测定方法的研究.中草药通讯，1978，(8)：7
收稿日期：1998-11-10, 百拇医药
单位：张丹 曾经泽(华西医科大学药学院 成都 610041)；李猛(成都市医药职大学生)
关键词：穿琥宁；穿心莲内酯；反相高效液相色谱法
药物分析杂志000111 摘 要：目的：建立反相高效液相色谱法测定穿琥宁及其注射液的含量。方法：采用μBondpak C18色谱柱，甲醇-水(70∶30)为流动相，250 nm为检测波长，室温下对穿琥宁及其注射剂进行含量测定。结果：能将穿琥宁及其主要杂质穿心莲内酯进行分离；穿琥宁在25～400 μg.mL-1范围内，峰面积与其浓度线性关系良好(r=0.999 9)；样品平均回收率为100.6%；日内精密度RSD为1.08%(n=5)，日间(10 d内)精密度RSD为2.06%(n=5)。结论：该法简便、快速、专属性强，可以满足其原料和制剂的质量控制要求。
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Determination of the Content of Potassium
Dehydroandrographolide Succinate by RP-HPLC
Zhang Dan Zeng Jingze Li Meng
(Pharmacy School of West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041)
Abstract：Objective：To establish a method using RP-HPLC for determination of the content of potassium dehydroandrographolide succinate and its injections.Method:The instrument was LC-3A HPLC with a μBondapak C18 column (25 cm×4.6 mm，10 μm),the mobile phase was methanol-water(70∶30) and the flow rate was 1.0 mL.min-1. The UV detection wavelength was 250 nm and column temperature was room temperature.Results:It can separate the potassium dehydroandrographolide succinate and its primary impurity andrographolide. The calibration curve was linear(r=0.999 9)within the range of 25～400 μg.mL-1 for potassium dehydroandrographolide succinate, the mean recovery was 100.6%， the within-day precision RSD was 1.08%(n=5) and day-to-day precision RSD was 2.06% (n=5) at three drug levels. Conclusion:This method is simple, quick and specific, suitable for the quality control of the drug and its preparation.
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Key words：potassium dehydroandrographolide succinate, andrographolide, RP-HPLC▲
穿琥宁(脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐，Potassium Dehydroandrographolide Succinate)是一种以穿心莲内酯为原料，经与琥珀酸酐等反应而制得的半合成药物，具有明显的抗炎解热作用，对病毒性肺炎、病毒性上感及急性细菌性痢疾等有较好疗效[1]。穿琥宁的含量测定，目前国内普遍采用分光光度法[2～4]。本文建立的反相高效液相色谱法，能将穿琥宁与有关杂质峰进行有效分离，不仅可测定穿琥宁及其注射剂的含量，而且可作为药物鉴别依据。该法简便、快速、灵敏度高、专属性强，国内外文献尚未见报道。该法适用于穿琥宁及其制剂的生产、贮存及临床应用中的质量控制。
1 仪器与色谱条件
, http://www.100md.com 日本岛津LC-3A液相色谱仪，SPD-1型紫外检测器，C-R1A型色谱数据处理机；美国Rheodyne 7725型液相色谱进样器。
色谱柱：μBondapak C18柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)；流动相：甲醇-水(70∶30)；流速：1.0 mL.min-1；检测波长：250 nm；柱温：室温。
2 药品及试剂
穿琥宁对照品：四川宜宾制药厂提供，含量：99.98%；穿心莲内酯对照品：中国药品生物制品检定所提供；穿琥宁原料及其注射剂：四川宜宾制药厂生产。实验用水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
3 线性范围
精密称取穿琥宁对照品适量，用50%甲醇溶解并稀释成含穿琥宁500 μg.mL-1的贮备液，冰箱内4 ℃保存；精密量取该贮备液适量，用50%甲醇配成含穿琥宁分别为25，50，100，200，300，400 μg.mL-1的标准溶液，各进样20 μL，按色谱条件测定。以穿琥宁峰面积(Y)对标准溶液浓度(X)进行线性回归，得回归方程：
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Y=-25+912.6X r=0.999 9 n=5
线性范围为25～400 μg.mL-1，检测限为0.1 μg(S/N=3)，定量限为25 μg.mL-1。
4 回收率试验
4.1 穿琥宁原料加样回收率试验 精密称取已知含量(99.96%)的穿琥宁原料适量，用50%甲醇溶解并配成一定浓度的溶液，加入不同量的穿琥宁对照品，依法进行回收率试验。5次测定结果平均回收率为100.7%～101.9%，RSD为1.18%。
4.2 穿琥宁注射剂加样回收率试验，精密量取已知标示量含量(90.19%)的穿琥宁注射剂适量，用50%甲醇配成一定浓度的溶液，加入不同量的穿琥宁对照品，依法进行回收率试验，5次测定结果平均回收率为99.35%～100.3%，RSD为1.62%。
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5 精密度试验
精密称取穿琥宁原料适量，用50%甲醇溶解并配成高、中、低3种浓度的溶液，同法测定后代入当日标准曲线求出其含量，考察日内及日间(10 d内)精密度。5次测定结果日内RSD<1.16%，日间RSD<2.54%。
6 样品测定
6.1 原料药含量测定 取样品约15 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取20 μL，注入色谱仪，记录色谱图(图1-A)，量取峰面积，代入当日标准曲线求出穿琥宁含量。结果见表1。
表1 穿琥宁原料含量测定结果(n=5) 批号
样品量/
μg.mL-1
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测得量/
μg.mL-1
含量/
%
RSD/
%
970901
153.2
152.6
98.89
1.17
970902
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149.0
148.4
98.71
1.47
970903
152.9
152.2
98.76
1.45
971201
153.2
153.2
99.96
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2.24
6.2 注射剂含量测定 精密量取注射剂(规格：20 mg.mL-1)1 mL，置100 mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀；精密量取20 μL，注入色谱仪，记录色谱图(图1-B、C)，量取峰面积，代入当日标准曲线求出穿琥宁含量。结果见表2。
图1 穿琥宁样品色谱图
A.穿琥宁原料 B.穿琥宁注射液 C.注射液空白
1.穿琥宁 2.穿心莲内酯
表2 穿琥宁注射液含量测定结果(n=5) 批号
样品量/
, 百拇医药
μg.mL-1
测得量/
μg.mL-1
标示百分含
量/%
RSD
%
970510
200.0
170.6
85.28
1.29
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970608
200.0
180.4
90.19
1.58
971210
200.0
209.4
104.7
1.59
980301
200.0
219.9
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109.9
1.00
7 讨论
7.1 按中国药典1995年版附录ⅤD规定方法，以穿琥宁峰计算色谱柱的理论塔板数约为1 780，穿琥宁与杂质穿心莲内酯的分离度约为4.3(见图1)。故建议用于穿琥宁含量测定的色谱柱，按穿琥宁峰计算的理论塔板数应不小于1 500，以确保其与溶剂峰及可能存在的杂质的分离度符合要求。
7.2 国内较早曾有采用比色法测定穿琥宁含量的报道[5]。虽然此法对仪器要求不高，操作较简便，但测定结果受试剂浓度、温度、显色时间等诸因素影响较大，故易引入测定误差。
7.3 穿心莲内酯是穿琥宁的主要杂质。产生原因一是由生产过程引入。因穿心莲内酯是合成穿琥宁的前体物质，在合成中有可能反应不够完全而带入成品中；二是在贮存过程中受外界条件影响，自身分解而产生。
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7.4 穿心莲内酯在穿琥宁测定波长(250 nm)处亦有吸收(图1-A、B)。所以若采用分光光度法测定，穿心莲内酯必然会对测定产生干扰。本文建立的反相高效液相色谱法，具有简便、快速(一次分析少于10 min)、灵敏、专属的特点，能将穿琥宁与穿心莲内酯完全分离，从而保证了测定结果的准确性。
7.5 据试验得知，穿琥宁对照品贮备液在冰箱4℃条件下2个月内浓度基本不变。但其稀释液(标准溶液系列)及样品溶液最好还是临用新配，以防药物在极稀溶液中分解损失。
7.6 由表2可见，市售不同批号的穿琥宁注射液中穿琥宁的含量相差较大，其中生产批号较早的含量较低。说明经过较长时间放置后，药物在溶液中存在分解损失现象。因此在临床应用中应特别注意药物的有效期，另外，对中药注射剂的稳定性研究亦应引起足够的重视。■
参考文献：
[1]邓文龙，聂仁吉，刘家玉等.穿心莲制剂炎宁—3药理作用初步研究.中草药通讯，1978，(8)：26
[2]张志荣，廖工铁，王炳南等.脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐在家兔体内的药代动力学研究.华西药学杂志，1991，6(3)：129
[3]北京市药品标准.1996.158
[4]四川省药品标准.1992.282
[5]邹昭明.脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐含量测定方法的研究.中草药通讯，1978，(8)：7
收稿日期：1998-11-10, 百拇医药