黄芪对实验性肝纤维化组织ICAM-1表达影响的免疫组化研究
作者：王要军 权启镇 孙自勤 齐凤 江学良 张修礼 王东
单位：济南军区总医院消化科,济南 250031
关键词：黄芪；肝纤维化；治疗；细胞间粘附分子-1
中国临床药理学与治疗学000114
目的 观察黄芪抗肝纤维化的疗效并探讨其机理。方法 用黄芪治疗CCl4诱导的肝纤维化模型，观察它对血清HA、肝组织纤维化评分及ICAM-1表达的影响。结果 黄芪组肝纤维化评分及血清HA明显低于模型组，肝组织中ICAM-1阳性细胞数明显减少。结论 黄芪有良好的抗肝纤维化作用，其机理可能与其抑制肝细胞中ICAM-1的表达有关。
中图分类号 R285.5
, 百拇医药
ICAM-1 expression in experimental fibrosis tissue affected by Radis Astragali
WANG Yao-Jun QUAN Qi-Zhen SUN Zi-Qin QI Feng JIANG Xue-Liang ZHANG Xiu-Li WANG Dong
(Department of Gastroenterology,General Hospital of Jinan Military Region,Jinan 250031)
Aim To observe the antifibrotic effect of Radis Astragali and to explore the mechanism.Methods The fibrosis of animal model was induced with CCl4,and the model animals were treated with Radis Astragali in treatment group and saline in control group respectively.Results The serum hyaluronic acid (HA),fibrosis score and ICAM-1-positive hepatocytes all the decreased in the treatment group as compared to those in the control group.Conclusion Radis Astragali has satisfactory effect on experimental fibrosis.The mechanism may be correlated with its affection on ICAM-1 in liver tissue.
, 百拇医药
Key Words Radis Astragali; liver fibrosis; therapy; ICAM-1
目前对肝纤维化和肝硬化的治疗尚缺乏有效的药物，细胞培养结果提示黄芪能抑制人成纤维细胞合成细胞外基质和表达细胞间粘附分子-1，(intercellular adhension molecule-1，ICAM-1)[1]，本文拟探讨黄芪对实验性肝纤维化的疗效及其对肝组织中ICAM-1表达的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 Wister大鼠30只，雄性，体重180～240 g，购自山东省实验动物中心，抗ICAM-1单克隆抗体为Zymed Lab.产品。ABC试剂盒均为Dako公司产品，透明质酸(HA)放免试剂盒为上海海军医学研究所产品。
1.2 动物模型及治疗 参考作者以往的方法[3]，6只大鼠作正常组，其余24只随机分为2组， 每组12只，采用40% CCl4花生油皮下注射1.2 ml.kg-1,每周2次，共14 wk，均自由饮水和饮食。黄芪组：于首次注射CCl4当日经口灌注黄芪水提液，(每ml含生药1g)1ml/只，每日1次，共14 wk。药物为市售正品，经山东中医药大学生药鉴定教研室王长墉教授鉴定无伪。模型组灌注生理盐水1ml，每日1次，方法及时间同黄芪组。于实验结束时处死动物，心内抽血测定HA。取肝组织，10%中性福尔马林固定，常规石蜡切片，进行常规病理检查、VG染色行肝纤维化评分[2]及ICAM-1免疫组化研究。
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1.3 血清HA测定 HA测定采用放射免疫分析法，按说明书操作。
1.4 ICAM-1免疫组化 同文献报道[4]，略加修改。组织切片常规脱蜡至水，微波炉抗原修复，1%H2O2-甲醇孵育30 min去除内源性过氧化物酶活性，1∶10正羊血清37 ℃孵育15 min，1∶50抗ICAM-1抗体4 ℃过夜，生物素标记羊抗鼠IgG 37 ℃孵育40 min，AB复合物37 ℃孵育50 min，DAB室温显色3 min，苏木素复染，封片观察。用正常鼠血清取代一抗为阴性对照。
1.5 统计学处理 计量资料采用
±s表示,采用t检验。
2 结果
2.1 肝组织病理学变化 模型组肝脏大体标本可见明显的肝硬化结节形成，而黄芪组几乎无明显异常。模型组肝组织全部出现肝纤维化，大量纤维组织增生和纤维隔形成并见假小叶充满肝组织，黄芪组仅见部分动物出现轻度至中度纤维化，肝脏炎细胞浸润、肝细胞浊肿变性明显减轻，部分正常。肝纤维化评分模型组为3.68±0.27，黄芪组为1.03±0.15 (P<0.01)。
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2.2 血清HA变化 模型组为(628.3±214.2)μg.L-1，黄芪组为(120.7±29.5) μg.L-1(P<0.01)，后者接近正常组的水平(112.4±21.6)g.L-1。
2.3 肝组织ICAM-1表达 肝细胞表达ICAM-1的结果判断参考Chu的方法分为4级[5]。正常状态下仅见肝组织中极少数肝窦周细胞、成纤维细胞有ICAM-1的表达，且表达强度较弱，肝细胞则无表达。而在模型组肝组织中上述细胞表达明显增强外，淋巴细胞也可见表达，且以肝细胞表达为主，主要表达于肝细胞膜，部分肝细胞浆染色阳性，肝纤维化越明显，肝细胞ICAM-1表达越强。黄芪组肝细胞表达明显减轻，见表1。
表1 黄芪对肝细胞表达ICAM-1的影响 组别
, 百拇医药 n
-
+
正常组
6
6
0
0
0
模型组
12
, http://www.100md.com 0
1
4
7
黄芪组
12
5
5
2
0
黄芪组与模型组相比P<0.01。-：肝细胞膜及胞浆无着色，+：肝细胞着色<10%,：肝细胞着色10%～50%，：肝细胞着色>50%。
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3 讨论
血清HA能敏感地反映肝纤维化的病理变化并可作为肝纤维化活动及动态变化的观察指标。黄芪组血清HA明显低于模型组。病理结果显示黄芪组肝细胞变性、坏死、纤维组织增生和纤维化明显轻于模型组，肝纤维化评分是目前广泛应用于肝纤维化研究的一种客观指标，本结果显示黄芪治疗组肝纤维化评分明显低于模型组，证实黄芪有确实的抗实验性肝纤维化疗效。
ICAM-1 是由5个前后排列的免疫球蛋白样区域组成的75-110kD的糖蛋白，属免疫球蛋白超基因家族成员，ICAM-1存在膜型和可溶性(sICAM-1)两种形式，sICAM-1存在于血清中。 ICAM-1具有与淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocyte function associated antigen-1,LFA -1)相结合的能力，它们的结合有利于免疫介导肝疾病炎性细胞的聚集并促进细胞从血管内移入狄氏间隙[6]。Thomson报道在慢活肝、急性病毒性肝炎、药物性肝病患者，血清ICAM-1均高于正常对照，且ICAM-1水平与肝功能损害指标显著相关，但经临床治疗后血清ICAM-1则有所下降。国内张绪清等[7]报道用ELISA法检测慢性乙型肝炎患者sICAM-1，发现肝炎患者血清ICAM-1明显高于正常人和慢性无症状HBsAg携带者，重度慢性肝炎患者血清ICAM-1水平明显高于中度慢性肝炎，中度慢性肝炎则高于轻度慢性肝炎，且ICAM-1水平越高，其血清胆红素越高、凝血酶原活动度则越低，ICAM-1水平与肝功能一致性较好、能较好地反映慢性乙肝患者的肝功能损害程度。血清ICAM-1升高可能与肝细胞坏死、肝细胞膜ICAM-1碎裂溶解入血有关[6],但组织中ICAM-1表达的免疫组化研究报道较少，Volpes报道在正常人肝细胞缺乏ICAM-1表达，肝窦内皮细胞和部分血管内皮细胞有少量ICAM-1表达，在肝炎时表达增强[8]。本文结果提示在正常肝组织中仅见极少数窦周细胞和成纤维细胞有ICAM-1的表达，且表达强度较弱，肝细胞则无表达。这与文献报道相一致。在肝纤维化时肝细胞ICAM-1表达阳性，且肝窦周细胞、成纤维细胞表达增强，ICAM-1表达越强，肝纤维化越明显，说明ICAM-1在肝纤维化的病理过程中起着重要的作用。黄芪不仅能抑制肝纤维化的形成还能抑制纤维化肝细胞、成纤维细胞的ICAM-1的表达，作者的细胞培养结果[1]已证实黄芪能抑制成纤维细胞表达ICAM-1和CD126，并认为这可能是黄芪抗肝纤维化的机理之一。结合以前结果我们认为黄芪抑制肝组织ICAM-1的表达，从而抑制肝纤维化时的免疫反应可能是其抗肝纤维化的重要机理之一。
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王要军，男，34岁，副主任医师，副教授。权启镇，男，58岁，主任医师，教授，硕士研究生导师。
参考文献
1，王要军，孙自勤，权启镇，等.黄芪对人成纤维细胞ICAM-1、CD126表达及合成ECM的影响.中国临床药理学与治疗学杂志，1991；4：209
2，孙自勤，王要军，权启镇，等.肝纤维化大鼠血清NO水平动态观察.滨州医学院学报，1998；21：560
3，王要军，孙自勤，权启镇，等.冬虫夏草对大鼠实验性肝纤维化的防治作用及其机理研究.中国中药杂志，1996；21：179
4，王要军，戴益民，张力.人原发性肝癌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的免疫组化研究.实用癌症杂志，1993；8：65
, 百拇医药 5，王援朝，骆抗先，汪能平.细胞间粘附分子-1在慢性乙型肝炎肝内的表达.解放军医学杂志， 1996；21：254
6，Horiike N,Onji M,Kumon I,et al.Intercellular adhension molecule-1 expression on the hepatocyte membrane of patients with chronic hepatitis B and C.Liver,1993;13:10
7，张绪清，顾长海，张娟.慢性乙型肝炎患者血清s ICAM-1水平及变化.中国免疫学杂志，1999；15：185
8，王要军，孙自勤，权启镇.部分粘附分子与慢性肝病.临床肝胆病杂志，1997；13：68
收稿日期：1999-11-16
修回日期：1999-12-27, http://www.100md.com
单位：济南军区总医院消化科,济南 250031
关键词：黄芪；肝纤维化；治疗；细胞间粘附分子-1
中国临床药理学与治疗学000114
目的 观察黄芪抗肝纤维化的疗效并探讨其机理。方法 用黄芪治疗CCl4诱导的肝纤维化模型，观察它对血清HA、肝组织纤维化评分及ICAM-1表达的影响。结果 黄芪组肝纤维化评分及血清HA明显低于模型组，肝组织中ICAM-1阳性细胞数明显减少。结论 黄芪有良好的抗肝纤维化作用，其机理可能与其抑制肝细胞中ICAM-1的表达有关。
中图分类号 R285.5
, 百拇医药
ICAM-1 expression in experimental fibrosis tissue affected by Radis Astragali
WANG Yao-Jun QUAN Qi-Zhen SUN Zi-Qin QI Feng JIANG Xue-Liang ZHANG Xiu-Li WANG Dong
(Department of Gastroenterology,General Hospital of Jinan Military Region,Jinan 250031)
Aim To observe the antifibrotic effect of Radis Astragali and to explore the mechanism.Methods The fibrosis of animal model was induced with CCl4,and the model animals were treated with Radis Astragali in treatment group and saline in control group respectively.Results The serum hyaluronic acid (HA),fibrosis score and ICAM-1-positive hepatocytes all the decreased in the treatment group as compared to those in the control group.Conclusion Radis Astragali has satisfactory effect on experimental fibrosis.The mechanism may be correlated with its affection on ICAM-1 in liver tissue.
, 百拇医药
Key Words Radis Astragali; liver fibrosis; therapy; ICAM-1
目前对肝纤维化和肝硬化的治疗尚缺乏有效的药物，细胞培养结果提示黄芪能抑制人成纤维细胞合成细胞外基质和表达细胞间粘附分子-1，(intercellular adhension molecule-1，ICAM-1)[1]，本文拟探讨黄芪对实验性肝纤维化的疗效及其对肝组织中ICAM-1表达的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 Wister大鼠30只，雄性，体重180～240 g，购自山东省实验动物中心，抗ICAM-1单克隆抗体为Zymed Lab.产品。ABC试剂盒均为Dako公司产品，透明质酸(HA)放免试剂盒为上海海军医学研究所产品。
1.2 动物模型及治疗 参考作者以往的方法[3]，6只大鼠作正常组，其余24只随机分为2组， 每组12只，采用40% CCl4花生油皮下注射1.2 ml.kg-1,每周2次，共14 wk，均自由饮水和饮食。黄芪组：于首次注射CCl4当日经口灌注黄芪水提液，(每ml含生药1g)1ml/只，每日1次，共14 wk。药物为市售正品，经山东中医药大学生药鉴定教研室王长墉教授鉴定无伪。模型组灌注生理盐水1ml，每日1次，方法及时间同黄芪组。于实验结束时处死动物，心内抽血测定HA。取肝组织，10%中性福尔马林固定，常规石蜡切片，进行常规病理检查、VG染色行肝纤维化评分[2]及ICAM-1免疫组化研究。
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1.3 血清HA测定 HA测定采用放射免疫分析法，按说明书操作。
1.4 ICAM-1免疫组化 同文献报道[4]，略加修改。组织切片常规脱蜡至水，微波炉抗原修复，1%H2O2-甲醇孵育30 min去除内源性过氧化物酶活性，1∶10正羊血清37 ℃孵育15 min，1∶50抗ICAM-1抗体4 ℃过夜，生物素标记羊抗鼠IgG 37 ℃孵育40 min，AB复合物37 ℃孵育50 min，DAB室温显色3 min，苏木素复染，封片观察。用正常鼠血清取代一抗为阴性对照。
1.5 统计学处理 计量资料采用
±s表示,采用t检验。2 结果
2.1 肝组织病理学变化 模型组肝脏大体标本可见明显的肝硬化结节形成，而黄芪组几乎无明显异常。模型组肝组织全部出现肝纤维化，大量纤维组织增生和纤维隔形成并见假小叶充满肝组织，黄芪组仅见部分动物出现轻度至中度纤维化，肝脏炎细胞浸润、肝细胞浊肿变性明显减轻，部分正常。肝纤维化评分模型组为3.68±0.27，黄芪组为1.03±0.15 (P<0.01)。
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2.2 血清HA变化 模型组为(628.3±214.2)μg.L-1，黄芪组为(120.7±29.5) μg.L-1(P<0.01)，后者接近正常组的水平(112.4±21.6)g.L-1。
2.3 肝组织ICAM-1表达 肝细胞表达ICAM-1的结果判断参考Chu的方法分为4级[5]。正常状态下仅见肝组织中极少数肝窦周细胞、成纤维细胞有ICAM-1的表达，且表达强度较弱，肝细胞则无表达。而在模型组肝组织中上述细胞表达明显增强外，淋巴细胞也可见表达，且以肝细胞表达为主，主要表达于肝细胞膜，部分肝细胞浆染色阳性，肝纤维化越明显，肝细胞ICAM-1表达越强。黄芪组肝细胞表达明显减轻，见表1。
表1 黄芪对肝细胞表达ICAM-1的影响 组别
, 百拇医药 n
-
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正常组
6
6
0
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模型组
12
, http://www.100md.com 0
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黄芪组
12
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黄芪组与模型组相比P<0.01。-：肝细胞膜及胞浆无着色，+：肝细胞着色<10%,
：肝细胞着色10%～50%，：肝细胞着色>50%。, http://www.100md.com
3 讨论
血清HA能敏感地反映肝纤维化的病理变化并可作为肝纤维化活动及动态变化的观察指标。黄芪组血清HA明显低于模型组。病理结果显示黄芪组肝细胞变性、坏死、纤维组织增生和纤维化明显轻于模型组，肝纤维化评分是目前广泛应用于肝纤维化研究的一种客观指标，本结果显示黄芪治疗组肝纤维化评分明显低于模型组，证实黄芪有确实的抗实验性肝纤维化疗效。
ICAM-1 是由5个前后排列的免疫球蛋白样区域组成的75-110kD的糖蛋白，属免疫球蛋白超基因家族成员，ICAM-1存在膜型和可溶性(sICAM-1)两种形式，sICAM-1存在于血清中。 ICAM-1具有与淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocyte function associated antigen-1,LFA -1)相结合的能力，它们的结合有利于免疫介导肝疾病炎性细胞的聚集并促进细胞从血管内移入狄氏间隙[6]。Thomson报道在慢活肝、急性病毒性肝炎、药物性肝病患者，血清ICAM-1均高于正常对照，且ICAM-1水平与肝功能损害指标显著相关，但经临床治疗后血清ICAM-1则有所下降。国内张绪清等[7]报道用ELISA法检测慢性乙型肝炎患者sICAM-1，发现肝炎患者血清ICAM-1明显高于正常人和慢性无症状HBsAg携带者，重度慢性肝炎患者血清ICAM-1水平明显高于中度慢性肝炎，中度慢性肝炎则高于轻度慢性肝炎，且ICAM-1水平越高，其血清胆红素越高、凝血酶原活动度则越低，ICAM-1水平与肝功能一致性较好、能较好地反映慢性乙肝患者的肝功能损害程度。血清ICAM-1升高可能与肝细胞坏死、肝细胞膜ICAM-1碎裂溶解入血有关[6],但组织中ICAM-1表达的免疫组化研究报道较少，Volpes报道在正常人肝细胞缺乏ICAM-1表达，肝窦内皮细胞和部分血管内皮细胞有少量ICAM-1表达，在肝炎时表达增强[8]。本文结果提示在正常肝组织中仅见极少数窦周细胞和成纤维细胞有ICAM-1的表达，且表达强度较弱，肝细胞则无表达。这与文献报道相一致。在肝纤维化时肝细胞ICAM-1表达阳性，且肝窦周细胞、成纤维细胞表达增强，ICAM-1表达越强，肝纤维化越明显，说明ICAM-1在肝纤维化的病理过程中起着重要的作用。黄芪不仅能抑制肝纤维化的形成还能抑制纤维化肝细胞、成纤维细胞的ICAM-1的表达，作者的细胞培养结果[1]已证实黄芪能抑制成纤维细胞表达ICAM-1和CD126，并认为这可能是黄芪抗肝纤维化的机理之一。结合以前结果我们认为黄芪抑制肝组织ICAM-1的表达，从而抑制肝纤维化时的免疫反应可能是其抗肝纤维化的重要机理之一。
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王要军，男，34岁，副主任医师，副教授。权启镇，男，58岁，主任医师，教授，硕士研究生导师。
参考文献
1，王要军，孙自勤，权启镇，等.黄芪对人成纤维细胞ICAM-1、CD126表达及合成ECM的影响.中国临床药理学与治疗学杂志，1991；4：209
2，孙自勤，王要军，权启镇，等.肝纤维化大鼠血清NO水平动态观察.滨州医学院学报，1998；21：560
3，王要军，孙自勤，权启镇，等.冬虫夏草对大鼠实验性肝纤维化的防治作用及其机理研究.中国中药杂志，1996；21：179
4，王要军，戴益民，张力.人原发性肝癌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的免疫组化研究.实用癌症杂志，1993；8：65
, 百拇医药 5，王援朝，骆抗先，汪能平.细胞间粘附分子-1在慢性乙型肝炎肝内的表达.解放军医学杂志， 1996；21：254
6，Horiike N,Onji M,Kumon I,et al.Intercellular adhension molecule-1 expression on the hepatocyte membrane of patients with chronic hepatitis B and C.Liver,1993;13:10
7，张绪清，顾长海，张娟.慢性乙型肝炎患者血清s ICAM-1水平及变化.中国免疫学杂志，1999；15：185
8，王要军，孙自勤，权启镇.部分粘附分子与慢性肝病.临床肝胆病杂志，1997；13：68
收稿日期：1999-11-16
修回日期：1999-12-27, http://www.100md.com