脓毒症小鼠肝窦内皮细胞细胞因子的基因表达
作者：吴荣谦 徐迎新 宋旭华 孟宪钧
单位：吴荣谦(解放军总医院普外科研究所， 北京100853)；徐迎新(解放军总医院普外科研究所， 北京100853)；宋旭华(解放军总医院普外科研究所， 北京100853)；孟宪钧(解放军总医院普外科研究所， 北京100853)
关键词：Wissler综合征/遗传学；基因表达；肿瘤坏死因子；白细胞介素1；白细胞介素6；内皮素
中国普通外科杂志000110 摘 要：目的 探讨肝窦内皮细胞细胞因子表达在脓毒症小鼠肝损伤中的作用。方法 采用盲肠结扎穿孔(CLP)制造小鼠脓毒症模型，假手术组(Sham)接受同样的手术操作但不行CLP。分别在致伤后3，12h分离肝窦内皮细胞，用RT-PCR的方法定量检测肝窦内皮细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)，白细胞介素1β(IL-1β)及白细胞介素6(IL-6)的基因表达。结果 肝窦内皮细胞TNF-α，IL-1β基因表达在CLP后3h即明显增高，至12h时虽有所降低但仍明显高于Sham组；IL-6基因的表达在CLP后3h明显增高，至CLP后12h仍维持在高水平。结论 肝窦内皮细胞是脓毒症时肝组织中细胞因子的重要来源之一。
, 百拇医药
分类号：R593.21；R730.3；R392.12 文献标识码：A
文章编号：1005-6947(2000)01-0032-03
Cytokine genes expression of hepatic sinusoidal endothelial in mice with sepsis
WU Rong-qian XU Ying-xin SONG Xu-hua MENG Xian-jun
(Institute of General Surgery Research, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China)
Abstract：Objective To investigate the role of cytokines genes expression of liver sinusoidal endothelial cells in liver damage by sepsis.Methods Septic mice models were established with cecal ligation and perforation (CLP), while sham operation group received the same procedure exclusive CLP. The genes expression of TNFα， IL-1β and IL-6 in liver sinusoidal endothelial cells were assessed by RT-PCR. Results A significant increase of TNFα, IL-1β genes expression was observed at 3h, and a slight decline at 12h after operation, but still significantly higher than that in the sham group; while IL-6 gene expression showed signficantly higher at 3h and remained at the high level at 12h. Conclusions Liver sinusoidal endothelial cell is an important source of cytokine production in mice with sepsis.
, 百拇医药
Key words：WISSLER’S SYNDROME/gent；GENE EXPRESSION；TUMOR NECROSIS FACTOR；INTERLEUKIN-1；INTERLEUKIN-6；ENDOTHELINS
CLC number： R593.21；R730.3；R392.12 Document code： A ■
脓毒症及其并发的多器官功能不全(MODS)一直是外科ICU的首要死因[1]。目前对其发病机制尚未完全清楚，但一般认为它的发生与机体免疫炎症反应密切相关，是过度炎症反应与代偿性抗炎症反应之间对比失衡的结果[2]。在对炎症反应的启动者细菌内毒素、炎症效应细胞(粒细胞、巨噬细胞)进行了大量的研究之后，内皮细胞作为炎症反应的另一重要参与者，近年来颇受重视[3]。内皮细胞已不再被认为仅仅是MODS发生时受损的靶细胞，而是炎症反应和继发器官损伤的积极参与者。目前对内皮细胞的研究多是通过体外培养方法进行，但体外与体内毕竟存在差异。本研究采用制造小鼠脓毒症模型后直接分离肝窦内皮细胞，在不同时相对肝窦内皮细胞促炎细胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6的基因表达进行动态观察和比较，以期为MODS的防治提出可能的新途径。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 脓毒症模型制作
选用雄性昆明小鼠，体重18～22g，由解放军总医院实验动物中心提供。随机分为2组：盲肠结扎穿孔组(cecal ligation and perforation,CLP 组)和假手术组(Sham组)，每组各12只。设2个 时间点(3，12h)取肝组织标本，每时间点6只。
1.2 肝窦内皮细胞分离
按Braet等[4]的方法稍加修改分离肝窦内皮细胞，主要步骤如下：肝脏经门静脉灌注、胶原酶消化后，以percoll梯度离心及选择性贴壁纯化肝窦内皮细胞。细胞计数，调整细胞浓度至1×106/ml。分离所得的细胞经台盼兰染色检测其存活率，并经Ⅷ因子相关抗原染色，流式细胞仪检测，测定其纯度。
, 百拇医药
1.3 细胞因子表达检测
采用异硫氰酸胍一步法提取肝窦内皮细胞中的总RNA，紫外分光光度计定量，取1μg RNA在逆转录酶的作用下合成cDNA。以β-actin或β2-MG为内对照基因扩增细胞因子基因。所用引物序列如下：β-actin(478bp):5`AGG GAA ATC GTG CGT GAC ATC AAA3',5`ACT CTA CGT ACT CCT GCT TGC TGA3';β2-MG(300bp):5`GGC TCG CTC GGT GAC CCT AGT CTT T3' ,5`TCT GCA GGC GTA TGT ATC AGT CTC A3';TNF-α(349bp):5`TTC TGT CCC TTT CAC TCA CTG G3',5`TTG GTG GTT TGC TAC GAC GTG G3';IL-1β(441bp):5`ATT AGA CAG CTG CAC TAC AGG CTC3',5`AGA TTC CAT GGT GAA GTC AAT TAT 3';IL-6(156bp):5`TGG AGT CAC AGA AGG AGT GGC TAA G3', 5`TCT GAC CAC AGT GAG GAA TGT CCA C3'。PCR反应体系为25μl，反应条件：95℃变性5min后，按94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 90s，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。取PCR反应产物10μl在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，用pBR322/Hinf Ⅰ做分子量标准来判断PCR产物片断大小，EB染色，紫外灯下观察并照相。底片在密度扫描仪上定量，以目的基因扩增量/内对照基因扩增量表示所要检测基因的表达量。
, http://www.100md.com
1.4 统计学处理
所有数据均以平均值±标准差(
±s)表示，用t检验进行统计学分析，以P<0.05为统计学差异显著。
2 结 果
2.1 肝窦内皮细胞鉴定、纯度及存活率
分离所得的肝窦内皮细胞经台盼兰染色显示其存活率大于90%，经Ⅷ因子相关抗原染色，流式细胞仪检测，显示Ⅷ因子相关抗原阳性细胞比例大于85%。
2.2 肝窦内皮细胞细胞因子基因表达
TNF-α，IL-1β基因表达在CLP后3h即明显增高，至12h时虽有所降低但仍明显高于Sham组；IL-6基因的表达在CLP后3h明显增高，至CLP后12h仍维持在高水平(附表)。
, 百拇医药
附表 肝窦内皮细胞细胞因子基因表达(±s) 组别
鼠数
TNF-α
I1-1β
I1-6
3h
12h
3h
12h
3h
12h
Sham组
, 百拇医药
6
0.23±0.04
0.22±0.04
0.30±0.04
0.39±0.06
0.47±0.05
0.49±0.05
CLP组
6
0.71±0.03
0.54±0.07
1.02±0.12
, http://www.100md.com
0.78±0.08
0.90±0.05
1.11±0.14
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
3 讨 论
在脓毒症并发的多器官损伤中，肝脏常受累。我们早在20世纪80年代就发现在低灌流、脓毒症等状态下，肝脏的能量代谢障碍发生最早、程度最重，并且与MODS时肺、肾等器官的功能衰竭密切相关[5]。因此研究脓毒症并发肝损伤的机制具有十分重要的意义。
, 百拇医药
细胞因子是一类由活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的小分子多肽。确立细胞因子在MODS发生中的作用是对MODS发生机制1次认识的深化和观念的更新，它将人们的注意力由外源性的刺激因素转移至机体自身的反应。各种急慢性疾病，多种原因均可导致机体细胞因子的产生。细胞因子本是机体正常防御反应的重要参与成分，但当刺激过于强烈细胞因子产生过度时，它们又可产生广泛的损伤作用[6]，是脓毒症并发远隔器官损伤的重要参与者。
关于MODS时细胞因子的来源，一般认为主要是来自过度激活的巨噬细胞[7]。近年来随着对内皮细胞免疫功能研究的深入，发现内皮细胞也可以分泌多种细胞因子，但少有研究涉及内皮细胞源性细胞因子在MODS中的作用。本研究在制作小鼠脓毒症模型后，直接分离肝窦内皮细胞，用RT-PCR的方法检测内皮细胞中多种细胞因子的基因表达，结果发现：CLP后，肝窦内皮细胞TNF-α，IL-1β，IL-6的表达均明显增高。从功能上讲，TNF-α，IL-1β和IL-6同属促炎症细胞因子，它们表达的升高可以促进一氧化氮、花生四烯酸代谢产物、缓激肽和组织胺等血管活性物质的产生，激活补体及中性粒细胞，促进中性粒细胞穿越血管内皮向组织中聚集，同时它们还可相互作用形成许多正反馈环，导致所谓“炎症级联效应”的发生。这些反应的结果是炎症反应的持续和加重。
, http://www.100md.com
由于内皮细胞分广泛、数量庞大，尤其是它分泌的炎症介质可在局部与血液中的炎性细胞和组织中的实质细胞直接接触，故内皮细胞源性细胞因子在MODS时机体免疫失衡中的作用不容忽视，在以细胞因子为靶标对MODS进行干预时也应充分考虑内皮细胞这个靶细胞，积极调节内皮细胞细胞因子的产生。■
基金项目：国家自然科学基金资助(39870796)
作者简介：吴荣谦(1971-)，男，湖北武汉人，解放军总医院普通外科
研究所助理研究员，博士，从事脓毒血症、MODS等方面研究。
参考文献：
[1]Baue AE, Durham R, Faist E. Systemic inflammatory response syndrome (SIRS), multiple organ dysfunction syndrome (MODS), multiple organ failure (MOF): are we winning the battle[J]. Shock, 1998,10(2):79～89
, 百拇医药
[2]Bone RC. Immunologic dissonance: a continuing evolution in our understanding of the systemic inflammatory response syndrome (SIRS) and the multiple organ dysfunction syndrome (MODS)[J]. Ann Inter Med, 1996,125(8):680～691
[3]McGill SN, Ahmed NA, Christon NV. Endothelial cells: role in infection and inflammation[J]. World J Surg,1998,22(2):171～178
[4]Braet F, De Zanger R, Sasaoki T, et al. Assessment of a method of isolation, purification, and cultivationn of rat liver sinusoidal endothelial cells[J].Lab Invest, 1994,70(6):944～952
, http://www.100md.com
[5]孟宪钧，王平，张平.肝脏在多器官功能衰竭中的作用[J].中华外科杂志，1988，26(1)：13～15
[6]Bone RC. Toward a theory regarding the pathogenesis of the systemic inflammatory response syndrome: what we do and do not know about cytokine regulation[J]. Crit Care Med,1996,24(1):163～172
[7]Gullo A, Berlot G. Ingredients of organ dysfunction or failure[J]. World J. Surg, 1996,20(4):430～436
收稿日期：1999-11-04
修改日期：1999-12-21, 百拇医药
单位：吴荣谦(解放军总医院普外科研究所， 北京100853)；徐迎新(解放军总医院普外科研究所， 北京100853)；宋旭华(解放军总医院普外科研究所， 北京100853)；孟宪钧(解放军总医院普外科研究所， 北京100853)
关键词：Wissler综合征/遗传学；基因表达；肿瘤坏死因子；白细胞介素1；白细胞介素6；内皮素
中国普通外科杂志000110 摘 要：目的 探讨肝窦内皮细胞细胞因子表达在脓毒症小鼠肝损伤中的作用。方法 采用盲肠结扎穿孔(CLP)制造小鼠脓毒症模型，假手术组(Sham)接受同样的手术操作但不行CLP。分别在致伤后3，12h分离肝窦内皮细胞，用RT-PCR的方法定量检测肝窦内皮细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)，白细胞介素1β(IL-1β)及白细胞介素6(IL-6)的基因表达。结果 肝窦内皮细胞TNF-α，IL-1β基因表达在CLP后3h即明显增高，至12h时虽有所降低但仍明显高于Sham组；IL-6基因的表达在CLP后3h明显增高，至CLP后12h仍维持在高水平。结论 肝窦内皮细胞是脓毒症时肝组织中细胞因子的重要来源之一。
, 百拇医药
分类号：R593.21；R730.3；R392.12 文献标识码：A
文章编号：1005-6947(2000)01-0032-03
Cytokine genes expression of hepatic sinusoidal endothelial in mice with sepsis
WU Rong-qian XU Ying-xin SONG Xu-hua MENG Xian-jun
(Institute of General Surgery Research, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China)
Abstract：Objective To investigate the role of cytokines genes expression of liver sinusoidal endothelial cells in liver damage by sepsis.Methods Septic mice models were established with cecal ligation and perforation (CLP), while sham operation group received the same procedure exclusive CLP. The genes expression of TNFα， IL-1β and IL-6 in liver sinusoidal endothelial cells were assessed by RT-PCR. Results A significant increase of TNFα, IL-1β genes expression was observed at 3h, and a slight decline at 12h after operation, but still significantly higher than that in the sham group; while IL-6 gene expression showed signficantly higher at 3h and remained at the high level at 12h. Conclusions Liver sinusoidal endothelial cell is an important source of cytokine production in mice with sepsis.
, 百拇医药
Key words：WISSLER’S SYNDROME/gent；GENE EXPRESSION；TUMOR NECROSIS FACTOR；INTERLEUKIN-1；INTERLEUKIN-6；ENDOTHELINS
CLC number： R593.21；R730.3；R392.12 Document code： A ■
脓毒症及其并发的多器官功能不全(MODS)一直是外科ICU的首要死因[1]。目前对其发病机制尚未完全清楚，但一般认为它的发生与机体免疫炎症反应密切相关，是过度炎症反应与代偿性抗炎症反应之间对比失衡的结果[2]。在对炎症反应的启动者细菌内毒素、炎症效应细胞(粒细胞、巨噬细胞)进行了大量的研究之后，内皮细胞作为炎症反应的另一重要参与者，近年来颇受重视[3]。内皮细胞已不再被认为仅仅是MODS发生时受损的靶细胞，而是炎症反应和继发器官损伤的积极参与者。目前对内皮细胞的研究多是通过体外培养方法进行，但体外与体内毕竟存在差异。本研究采用制造小鼠脓毒症模型后直接分离肝窦内皮细胞，在不同时相对肝窦内皮细胞促炎细胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6的基因表达进行动态观察和比较，以期为MODS的防治提出可能的新途径。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 脓毒症模型制作
选用雄性昆明小鼠，体重18～22g，由解放军总医院实验动物中心提供。随机分为2组：盲肠结扎穿孔组(cecal ligation and perforation,CLP 组)和假手术组(Sham组)，每组各12只。设2个 时间点(3，12h)取肝组织标本，每时间点6只。
1.2 肝窦内皮细胞分离
按Braet等[4]的方法稍加修改分离肝窦内皮细胞，主要步骤如下：肝脏经门静脉灌注、胶原酶消化后，以percoll梯度离心及选择性贴壁纯化肝窦内皮细胞。细胞计数，调整细胞浓度至1×106/ml。分离所得的细胞经台盼兰染色检测其存活率，并经Ⅷ因子相关抗原染色，流式细胞仪检测，测定其纯度。
, 百拇医药
1.3 细胞因子表达检测
采用异硫氰酸胍一步法提取肝窦内皮细胞中的总RNA，紫外分光光度计定量，取1μg RNA在逆转录酶的作用下合成cDNA。以β-actin或β2-MG为内对照基因扩增细胞因子基因。所用引物序列如下：β-actin(478bp):5`AGG GAA ATC GTG CGT GAC ATC AAA3',5`ACT CTA CGT ACT CCT GCT TGC TGA3';β2-MG(300bp):5`GGC TCG CTC GGT GAC CCT AGT CTT T3' ,5`TCT GCA GGC GTA TGT ATC AGT CTC A3';TNF-α(349bp):5`TTC TGT CCC TTT CAC TCA CTG G3',5`TTG GTG GTT TGC TAC GAC GTG G3';IL-1β(441bp):5`ATT AGA CAG CTG CAC TAC AGG CTC3',5`AGA TTC CAT GGT GAA GTC AAT TAT 3';IL-6(156bp):5`TGG AGT CAC AGA AGG AGT GGC TAA G3', 5`TCT GAC CAC AGT GAG GAA TGT CCA C3'。PCR反应体系为25μl，反应条件：95℃变性5min后，按94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 90s，扩增30个循环，最后72℃延伸10min。取PCR反应产物10μl在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，用pBR322/Hinf Ⅰ做分子量标准来判断PCR产物片断大小，EB染色，紫外灯下观察并照相。底片在密度扫描仪上定量，以目的基因扩增量/内对照基因扩增量表示所要检测基因的表达量。
, http://www.100md.com
1.4 统计学处理
所有数据均以平均值±标准差(
±s)表示，用t检验进行统计学分析，以P<0.05为统计学差异显著。2 结 果
2.1 肝窦内皮细胞鉴定、纯度及存活率
分离所得的肝窦内皮细胞经台盼兰染色显示其存活率大于90%，经Ⅷ因子相关抗原染色，流式细胞仪检测，显示Ⅷ因子相关抗原阳性细胞比例大于85%。
2.2 肝窦内皮细胞细胞因子基因表达
TNF-α，IL-1β基因表达在CLP后3h即明显增高，至12h时虽有所降低但仍明显高于Sham组；IL-6基因的表达在CLP后3h明显增高，至CLP后12h仍维持在高水平(附表)。
, 百拇医药
附表 肝窦内皮细胞细胞因子基因表达(
±s) 组别鼠数
TNF-α
I1-1β
I1-6
3h
12h
3h
12h
3h
12h
Sham组
, 百拇医药
6
0.23±0.04
0.22±0.04
0.30±0.04
0.39±0.06
0.47±0.05
0.49±0.05
CLP组
6
0.71±0.03
0.54±0.07
1.02±0.12
, http://www.100md.com
0.78±0.08
0.90±0.05
1.11±0.14
P值
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
<0.01
3 讨 论
在脓毒症并发的多器官损伤中，肝脏常受累。我们早在20世纪80年代就发现在低灌流、脓毒症等状态下，肝脏的能量代谢障碍发生最早、程度最重，并且与MODS时肺、肾等器官的功能衰竭密切相关[5]。因此研究脓毒症并发肝损伤的机制具有十分重要的意义。
, 百拇医药
细胞因子是一类由活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的小分子多肽。确立细胞因子在MODS发生中的作用是对MODS发生机制1次认识的深化和观念的更新，它将人们的注意力由外源性的刺激因素转移至机体自身的反应。各种急慢性疾病，多种原因均可导致机体细胞因子的产生。细胞因子本是机体正常防御反应的重要参与成分，但当刺激过于强烈细胞因子产生过度时，它们又可产生广泛的损伤作用[6]，是脓毒症并发远隔器官损伤的重要参与者。
关于MODS时细胞因子的来源，一般认为主要是来自过度激活的巨噬细胞[7]。近年来随着对内皮细胞免疫功能研究的深入，发现内皮细胞也可以分泌多种细胞因子，但少有研究涉及内皮细胞源性细胞因子在MODS中的作用。本研究在制作小鼠脓毒症模型后，直接分离肝窦内皮细胞，用RT-PCR的方法检测内皮细胞中多种细胞因子的基因表达，结果发现：CLP后，肝窦内皮细胞TNF-α，IL-1β，IL-6的表达均明显增高。从功能上讲，TNF-α，IL-1β和IL-6同属促炎症细胞因子，它们表达的升高可以促进一氧化氮、花生四烯酸代谢产物、缓激肽和组织胺等血管活性物质的产生，激活补体及中性粒细胞，促进中性粒细胞穿越血管内皮向组织中聚集，同时它们还可相互作用形成许多正反馈环，导致所谓“炎症级联效应”的发生。这些反应的结果是炎症反应的持续和加重。
, http://www.100md.com
由于内皮细胞分广泛、数量庞大，尤其是它分泌的炎症介质可在局部与血液中的炎性细胞和组织中的实质细胞直接接触，故内皮细胞源性细胞因子在MODS时机体免疫失衡中的作用不容忽视，在以细胞因子为靶标对MODS进行干预时也应充分考虑内皮细胞这个靶细胞，积极调节内皮细胞细胞因子的产生。■
基金项目：国家自然科学基金资助(39870796)
作者简介：吴荣谦(1971-)，男，湖北武汉人，解放军总医院普通外科
研究所助理研究员，博士，从事脓毒血症、MODS等方面研究。
参考文献：
[1]Baue AE, Durham R, Faist E. Systemic inflammatory response syndrome (SIRS), multiple organ dysfunction syndrome (MODS), multiple organ failure (MOF): are we winning the battle[J]. Shock, 1998,10(2):79～89
, 百拇医药
[2]Bone RC. Immunologic dissonance: a continuing evolution in our understanding of the systemic inflammatory response syndrome (SIRS) and the multiple organ dysfunction syndrome (MODS)[J]. Ann Inter Med, 1996,125(8):680～691
[3]McGill SN, Ahmed NA, Christon NV. Endothelial cells: role in infection and inflammation[J]. World J Surg,1998,22(2):171～178
[4]Braet F, De Zanger R, Sasaoki T, et al. Assessment of a method of isolation, purification, and cultivationn of rat liver sinusoidal endothelial cells[J].Lab Invest, 1994,70(6):944～952
, http://www.100md.com
[5]孟宪钧，王平，张平.肝脏在多器官功能衰竭中的作用[J].中华外科杂志，1988，26(1)：13～15
[6]Bone RC. Toward a theory regarding the pathogenesis of the systemic inflammatory response syndrome: what we do and do not know about cytokine regulation[J]. Crit Care Med,1996,24(1):163～172
[7]Gullo A, Berlot G. Ingredients of organ dysfunction or failure[J]. World J. Surg, 1996,20(4):430～436
收稿日期：1999-11-04
修改日期：1999-12-21, 百拇医药