HPLC法测定环孢素口服液的含量
作者：王建 张华
单位：王建 张华(浙江省药品检验所， 杭州310004)；张华(舟山市药品检验所)
关键词：环孢素口服液；高效液相色谱法； 测定
中国抗生素杂志000108 摘 要 用HPLC法测定环孢素口服液的含量。以NOVA-PAK C18为色谱柱，乙腈-水-甲醇-磷酸(550∶400∶50∶0.5)为流动相，柱温为50℃，检测波长225nm，线性关系r=0.9992，平均回收率为99.9%(RSD=0.63%，n=6)，精密度RSD=0.64%(n=6)。方法简便、准确，可用于环孢素口服液的质量控制。
HPLC determination of ciclosporin oral solution
Wang Jian and Zhang Hua
, http://www.100md.com
(Zhejiang Institute for Drug Control， Hangzhou 310004)
ABSTRACT Ciclosporin oral solution was determined by a modified HPLC method. The separation was performed on a NOVA-PAK C18 column. The mobile phase was acetonitrile-water-methanol-phosphoric acid (550∶400∶50∶0.5). They UV detector was set at 225nm. The average recovery was 99.9% (RSD=0.63%, n=6), with good linear relationship (r=0.9992) and precision (RSD=0.64%, n=6). The method was simple and accurate and can be used for the quality control of ciclosporin oral solution.
, 百拇医药
KEY WORDS Ciclosporin oral solution； HPLC； Determination
环孢素口服液收载于USP23版[1]其含量测定方法采用二甲基硅烷键合硅胶柱(L16柱)，国内无此柱生产供应，因此，国内药厂开发这个新药时，含量测定做了国产化研究工作，在常用的C18柱上分离测定环孢素的含量[卫生部标准(试行)WS-08(X-05)-93；WS-282(X-244)-96(1)；WS-107(X-095)-96]。环孢素口服液中含有植物油、表面活性剂等辅料，对环孢素含量测定易产生干扰，我们在起草《中国药典》2000年版该品种过程中，发现按卫生部试行标准检验，在环孢素出峰位置，有一辅料干扰峰存在(约占主成分峰峰面积的2%)，见图1。本文通过试验，改进了环孢素口服液含量测定的色谱条件，有效地排除了干扰，实验结果满意。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 仪器
日本岛津LC-6A液相色谱仪，SPD-6AV检测器，C-R4A色谱数据处理仪。
1.2 药品与试剂
环孢素对照品由本所标化；环孢素口服液，由杭州中美华东制药有限公司提供；乙腈、甲醇均为色谱纯试剂。
1.3 色谱条件
色谱柱：大连化学物理研究所NOVA-PAK C18柱(4.6mm×200mm，4μm)；流动相：乙腈-水-甲醇-磷酸(550∶400∶50∶0.5)；流速：1.0ml/min；柱温：50℃；紫外检测波长：225nm；进样量：10μl。
2 实验与结果
2.1 专属性
, 百拇医药
在上述色谱条件下，色谱图见图2，空白辅料不干扰环孢素的含量测定。环孢素(A组分)的保留时间为15.0min，环孢菌素B、D组分的保留时间分别为11.9、20.8min，不干扰环孢素的测定。
2.2 线性关系
取环孢素对照品适量，精密称定，加乙腈-氯仿(4∶1)溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含环孢素2.0mg的溶液，分别取此液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml，置5ml量瓶中，用上述溶剂稀释至刻度，摇匀。照上述色谱条件，精密量取10μl注入液相色谱仪，色谱峰面积(A)与浓度(C)在0.4～2.0mg/ml范围内呈良好的线性关系，回归方程：A=1.632×104+2.230×106C，相关系数r=0.9992。
图1 卫生部试行标准法色谱图
, http://www.100md.com
1：环孢素
图2 本法色谱图
1：环孢素测定。
2.3 回收率测定
按照处方配比，精密称取环孢素适量，加入空白辅料中，混匀，共制备6份。各份均按含量测定项下的方法进行测定，计算回收率，结果见表1。
表1 回收率测定结果 加入量
(mg)
回收量
(mg)
回收率
, http://www.100md.com
(%)
平均回收率
(%)
RSD
(%)
18.15
18.17
100.1
99.9
0.63
18.15
18.24
100.5
, http://www.100md.com
18.15
18.15
100.0
19.87
19.91
100.2
19.87
19.61
98.7
19.87
19.89
100.1
2.4 精密度试验
, 百拇医药
精密称取同一批号样品6份，按含量测定项下的方法进行测定，含量分别为101.1%、99.7%、99.5%、99.5%、99.8%、99.4%，RSD为0.64%。
2.5 供试品溶液稳定性
本品用乙腈-氯仿(4∶1)溶液溶解后立即进样，测得主峰峰面积为1022853，48h后再进样测定，主峰峰面积为1022365，说明供试品溶液稳定。
2.6 含量测定
精密称取本品约0.1g，置10ml量瓶中，用乙腈-氯仿(4∶1)溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，照上述色谱条件，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，量取峰面积；另取环孢素对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，同法稀释、测定，按外标法计算并用相对密度换算成mg/ml，即得。结果见表2。 表2 含量测定结果(标示量%，n=2) 批号
, http://www.100md.com
本法
卫生部试行标准法
980701
99.8
101.2
980702
100.0
101.2
980604
99.6
101.1
3 讨论
3.1 在NOVA-PAK C18柱上，试验卫生部试行标准法：①乙腈-水(62.5∶37.5)，柱温55℃，210nm检测；②乙腈-水-甲醇-磷酸(550∶400∶50∶0.5)，柱温50℃，210nm检测；③乙腈-磷酸盐缓冲液(pH2.0)(67.5∶32.5)，柱温60℃，210nm检测等流动相，均未能把环孢素与辅料干扰峰分开。
, 百拇医药
3.2 在NOVA-PAK C18柱上，以乙睛-水-甲醇-磷酸(550∶400∶50∶0.5)为流动相，检测波长从210nm逐渐增大，辅料干扰峰逐渐减小，至225nm时基本上消失。检测波长从210nm增大到225nm，辅料干扰峰峰面积降低40倍，环孢素峰峰面积降低2.5倍，环孢素的检测灵敏度虽然有所下降，但足以满足含量测定要求，线性关系良好，因此确定测定波长从卫生部试行标准中的210nm改为225nm。从图1、图2对比色谱图，及表2对比含量测定结果可知，本法有效地排除了辅料干扰峰的干扰。
3.3 柱温对环孢素峰形影响较大，室温下色谱峰较宽，柱温升高色谱峰变窄，但柱温过高影响色谱柱的寿命，测定时仪器也不容易稳定，因此确定柱温为50℃。
3.4 经试验，本法适用于环孢素口服液的含量测定外，同时也适用于环孢素软胶囊的含量测定。
王建，男，生于1963年，硕士，副主任药师。
参考文献
1，United States Pharmacopeia Convention Inc.The United States Pharmacopeia.XXⅢ Tamnton：Rand McNally，1995：445
1998年11月16日收稿, http://www.100md.com
单位：王建 张华(浙江省药品检验所， 杭州310004)；张华(舟山市药品检验所)
关键词：环孢素口服液；高效液相色谱法； 测定
中国抗生素杂志000108 摘 要 用HPLC法测定环孢素口服液的含量。以NOVA-PAK C18为色谱柱，乙腈-水-甲醇-磷酸(550∶400∶50∶0.5)为流动相，柱温为50℃，检测波长225nm，线性关系r=0.9992，平均回收率为99.9%(RSD=0.63%，n=6)，精密度RSD=0.64%(n=6)。方法简便、准确，可用于环孢素口服液的质量控制。
HPLC determination of ciclosporin oral solution
Wang Jian and Zhang Hua
, http://www.100md.com
(Zhejiang Institute for Drug Control， Hangzhou 310004)
ABSTRACT Ciclosporin oral solution was determined by a modified HPLC method. The separation was performed on a NOVA-PAK C18 column. The mobile phase was acetonitrile-water-methanol-phosphoric acid (550∶400∶50∶0.5). They UV detector was set at 225nm. The average recovery was 99.9% (RSD=0.63%, n=6), with good linear relationship (r=0.9992) and precision (RSD=0.64%, n=6). The method was simple and accurate and can be used for the quality control of ciclosporin oral solution.
, 百拇医药
KEY WORDS Ciclosporin oral solution； HPLC； Determination
环孢素口服液收载于USP23版[1]其含量测定方法采用二甲基硅烷键合硅胶柱(L16柱)，国内无此柱生产供应，因此，国内药厂开发这个新药时，含量测定做了国产化研究工作，在常用的C18柱上分离测定环孢素的含量[卫生部标准(试行)WS-08(X-05)-93；WS-282(X-244)-96(1)；WS-107(X-095)-96]。环孢素口服液中含有植物油、表面活性剂等辅料，对环孢素含量测定易产生干扰，我们在起草《中国药典》2000年版该品种过程中，发现按卫生部试行标准检验，在环孢素出峰位置，有一辅料干扰峰存在(约占主成分峰峰面积的2%)，见图1。本文通过试验，改进了环孢素口服液含量测定的色谱条件，有效地排除了干扰，实验结果满意。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 仪器
日本岛津LC-6A液相色谱仪，SPD-6AV检测器，C-R4A色谱数据处理仪。
1.2 药品与试剂
环孢素对照品由本所标化；环孢素口服液，由杭州中美华东制药有限公司提供；乙腈、甲醇均为色谱纯试剂。
1.3 色谱条件
色谱柱：大连化学物理研究所NOVA-PAK C18柱(4.6mm×200mm，4μm)；流动相：乙腈-水-甲醇-磷酸(550∶400∶50∶0.5)；流速：1.0ml/min；柱温：50℃；紫外检测波长：225nm；进样量：10μl。
2 实验与结果
2.1 专属性
, 百拇医药
在上述色谱条件下，色谱图见图2，空白辅料不干扰环孢素的含量测定。环孢素(A组分)的保留时间为15.0min，环孢菌素B、D组分的保留时间分别为11.9、20.8min，不干扰环孢素的测定。
2.2 线性关系
取环孢素对照品适量，精密称定，加乙腈-氯仿(4∶1)溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含环孢素2.0mg的溶液，分别取此液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml，置5ml量瓶中，用上述溶剂稀释至刻度，摇匀。照上述色谱条件，精密量取10μl注入液相色谱仪，色谱峰面积(A)与浓度(C)在0.4～2.0mg/ml范围内呈良好的线性关系，回归方程：A=1.632×104+2.230×106C，相关系数r=0.9992。
图1 卫生部试行标准法色谱图
, http://www.100md.com
1：环孢素
图2 本法色谱图
1：环孢素测定。
2.3 回收率测定
按照处方配比，精密称取环孢素适量，加入空白辅料中，混匀，共制备6份。各份均按含量测定项下的方法进行测定，计算回收率，结果见表1。
表1 回收率测定结果 加入量
(mg)
回收量
(mg)
回收率
, http://www.100md.com
(%)
平均回收率
(%)
RSD
(%)
18.15
18.17
100.1
99.9
0.63
18.15
18.24
100.5
, http://www.100md.com
18.15
18.15
100.0
19.87
19.91
100.2
19.87
19.61
98.7
19.87
19.89
100.1
2.4 精密度试验
, 百拇医药
精密称取同一批号样品6份，按含量测定项下的方法进行测定，含量分别为101.1%、99.7%、99.5%、99.5%、99.8%、99.4%，RSD为0.64%。
2.5 供试品溶液稳定性
本品用乙腈-氯仿(4∶1)溶液溶解后立即进样，测得主峰峰面积为1022853，48h后再进样测定，主峰峰面积为1022365，说明供试品溶液稳定。
2.6 含量测定
精密称取本品约0.1g，置10ml量瓶中，用乙腈-氯仿(4∶1)溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，照上述色谱条件，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，量取峰面积；另取环孢素对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，同法稀释、测定，按外标法计算并用相对密度换算成mg/ml，即得。结果见表2。 表2 含量测定结果(标示量%，n=2) 批号
, http://www.100md.com
本法
卫生部试行标准法
980701
99.8
101.2
980702
100.0
101.2
980604
99.6
101.1
3 讨论
3.1 在NOVA-PAK C18柱上，试验卫生部试行标准法：①乙腈-水(62.5∶37.5)，柱温55℃，210nm检测；②乙腈-水-甲醇-磷酸(550∶400∶50∶0.5)，柱温50℃，210nm检测；③乙腈-磷酸盐缓冲液(pH2.0)(67.5∶32.5)，柱温60℃，210nm检测等流动相，均未能把环孢素与辅料干扰峰分开。
, 百拇医药
3.2 在NOVA-PAK C18柱上，以乙睛-水-甲醇-磷酸(550∶400∶50∶0.5)为流动相，检测波长从210nm逐渐增大，辅料干扰峰逐渐减小，至225nm时基本上消失。检测波长从210nm增大到225nm，辅料干扰峰峰面积降低40倍，环孢素峰峰面积降低2.5倍，环孢素的检测灵敏度虽然有所下降，但足以满足含量测定要求，线性关系良好，因此确定测定波长从卫生部试行标准中的210nm改为225nm。从图1、图2对比色谱图，及表2对比含量测定结果可知，本法有效地排除了辅料干扰峰的干扰。
3.3 柱温对环孢素峰形影响较大，室温下色谱峰较宽，柱温升高色谱峰变窄，但柱温过高影响色谱柱的寿命，测定时仪器也不容易稳定，因此确定柱温为50℃。
3.4 经试验，本法适用于环孢素口服液的含量测定外，同时也适用于环孢素软胶囊的含量测定。
王建，男，生于1963年，硕士，副主任药师。
参考文献
1，United States Pharmacopeia Convention Inc.The United States Pharmacopeia.XXⅢ Tamnton：Rand McNally，1995：445
1998年11月16日收稿, http://www.100md.com