o-T比色法测定无花果中糖类化合物的实验研究
作者：张积霞 贺志安 席荣英 王东霞
单位：新乡医学院化学教研室(456003)
关键词：无花果；糖类化合物；o-T比色法
中草药991111摘 要 建立了o-T比色法测定无花果中糖类化合物的含量测定方法，波长630 nm，线性范围0.2～2 mg/mL， RSD=4.6%，回收率99.47%。该法显色灵敏，不必沉淀蛋白质，不受还原性物质的干扰，较其它方法操作简便，方法特异，准确，重复性好。既能测定总糖，还能测定还原糖，从而间接地得出多糖的含量，适用于中草药中糖类化合物含量的测定。
无花果Ficus carica L. 为桑科榕属植物，具有健胃清肠，消食解毒之功效。其果实含有抗癌有效成分〔1～4〕和多种营养成分。其中糖类化合物是主要营养成分之一。目前糖的测定方法已有报道〔5～7〕，但有的只能测定总糖，不能排除还原性物质的干扰或操作繁琐或结果误差大等。我们采用邻甲苯胺法测定无花果中糖类化合物含量，结果满意。
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1 仪器及试剂
CL-770 分光光度计(日本岛津)，7230型分光光度计(中国上海)。
样品为采自河南省豫北地区的无花果熟果、幼果及叶的烘干粉末(60～100目)。所用试剂均为分析纯，标准品：葡萄糖2 mg/mL。
o-T试剂：940 mL冰乙酸中加入1.5 g硫脲，60 mL邻甲苯胺混合，直至硫脲完全溶解，置棕色瓶中，室温保存24 h后使用。
2 方法与结果
2.1 实验方法：取样品1 mL，加入o-T试剂5 mL，沸水浴30 min，取出冷水冷却，于630 nm处，用0.5 cm比色皿，以试剂空白调零测吸收度值。
2.2 条件实验
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2.2.1 吸收光谱测定：葡萄糖标准品与o-T试剂显色稳定后在CL-770分光光度计上测定吸收光谱，如图1所示，波长宽度(325～1100 nm)。由图可知，葡萄糖与o-T试剂反应后的最大吸收峰在630 nm处。
图1 葡萄糖与o-T试剂的吸收光谱
2.2.2 显色时间及稳定性：取试管7 支均加水解液1 mL、o-T试剂5 mL混匀置沸水浴中，分别在5，10，15，20，25，30，35 min分别取出冷却测吸收度，结果以煮沸30 min时吸收度值最大，冷却后30 min内显色稳定。
2.2.3 显色剂用量的选择：取试管7 支加标准液与显色试剂之比分别为1∶1～7，按上述方法沸水浴30 min冷却，结果两者之比为1∶5时吸收度最大，其它比例吸收度值均降低。本文采用5 mL。
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2.2.4 水解条件的选择：精密称取样品(熟果)0.5 g共7 份，分别加入2%，10%，15%，20%，30%，40%，50% HCl 50 mL，沸水浴水解并于10，20，30，40，50 min，1，1.5，2，2.5，3 h分别取出1 mL加o-T试剂5 mL同前试验，然后测吸收度值。结果用20% HCl水解30 min时，吸收度值最大，水解最完全。
2.2.5 标准曲线的制作：精密吸取葡萄糖标准液(2 mg/mL)0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，补充蒸馏水到1 mL，按实验方法显色，测吸收度值。求得回归方程为A=0.7819C+0.03614，r=0.9992。糖含量在0.2～2 mg/mL内服从比耳定律。
2.2.6 精密度：取水解后的同一样品一天内测定10 次，结果RSD=4.6%。
2.3 结果
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2.3.1 可溶性糖类化合物的测定：精密称取无花果熟果、幼果和叶的干燥恒重粉末0.25 g于试管中(平行做3份)，加入15 mL 80%乙醇，塞紧，50 ℃水浴提取30 min，倾出上清液，残渣再用80%乙醇提取3次，合并定容至100 mL，按实验方法显色测吸收度值，由回归方程计算含量。见表1。
表1 无花果可溶性糖含量测定结果 样品
熟果
幼果
叶
含量(%)
54.32
24.40
15.45
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2.3.2 总糖含量测定：精密称取无花果熟果、幼果及叶的干燥粉末0.25 g于60 mL圆底磨口蒸馏瓶中(平行做3 份)，加入20% HCl 20 mL，塞紧，沸水浴水解30 min，取出，冷水冷却，滴加甲基红指示剂一滴，用20% NaOH中和至微酸性(pH=6～7)，转移到100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，混匀过滤，以下按实验方法显色测吸收度值，由回归方程计算总糖含量。结果见表2。表2 总糖及多糖含量测定结果 样品
熟果
青果
叶
总糖含量(%)
62.08
31.56
29.54
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多糖含量(%)
8.76
7.16
14.09
2.3.3 回收率试验：精密称取熟果粉末0.25 g于蒸馏瓶中，加入1.0 mg葡萄糖，以下同总糖含量测定，结果回收率99.47%。
3 讨论
3.1 还原糖o-T试剂显色生成绿色溶液，在630 nm处有最大吸收峰，但从吸收光谱可以看出，在325～500 nm之间有更大吸收峰，所以作者将溶液稀释，使吸收光谱放大(如图2所示)，在325～500 nm之间为一群杂乱无章的吸收峰群，实际测定效果亦差。因此，本文选择了630 nm为测定波长。
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图2 葡萄糖与o-T试剂的吸收光谱
3.2 葡萄糖与o-T试剂沸水浴显色10 min时吸收度值最大，延长时间略有降低，但水解液与o-T试剂沸水浴显色30 min吸收度值最大，由于无花果中不但含有葡萄糖，而且还含有其它一些还原糖，为了使实验方法与标准曲线中方法一致，本文选用显色30 min。作者经实验表明葡萄糖与o-T试剂显色30 min所作的标准曲线求出的总糖含量与显色10 min相差无几，可以肯定，显色30 min对总糖测定无明显影响。
3.3 氧化亚铜法、Somogyi法、间接碘量等测定总糖多需除蛋白〔5～7〕再行测定，不仅操作繁琐，而且误差大，本实验方法不必沉淀蛋白质(作者作了对照实验)，减少了操作误差，显色灵敏，操作简便。但在水解后调pH时，不能调成碱性，应稍偏酸性，实验证实，调成碱性(或再用HCl调成微酸性)都降低显色后溶液的吸收度，使测量结果偏低。
, http://www.100md.com 3.4 Vit C是多种植物及果实中的重要营养成分，在碱性条件下具有较强的还原性〔8〕，常干扰碘量法、氧化亚铜法、Somogyi法等总糖测定，使结果偏高，本法利用o-T试剂在强酸性环境中加热与糖类的醛基所发生的反应，不受Vit C的干扰，经作者证实样品含有90 mg/100 g Vit C不影响本实验，因此该法较前几种方法特异，准确。
3.5 多糖类化合物是多种中草药的有效成分之一，某些多糖还具有抗癌、抗炎、抗病毒、提高免疫力等作用〔9〕，而多糖多无法直接测定〔6〕。本法既能测定总糖，还可测定还原糖，二者之差即为多糖，这样可粗略估计中草药中多糖的含量，有利于制剂的质量评定。
3.6 从实验结果可以看出，无花果熟果糖量较高，幼果与叶中糖量无多大差别，其可溶性糖类的定性鉴别，有待进一步继续研究。
致谢：在本实验的研究过程中，得到了尹卫平博士的亲自指导，在此表示感谢。
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基金项目：河南省科委资助课题
作者简介：张积霞，女，33岁，河南新乡医学院临床医学本科毕业，实验师，1987年分配
至新乡医学院化学教研室从事教学和科研工作，曾获厅级科研成果奖两项，在
正式刊物上发表学术论文7篇.目前研究的方向：中草药有效万分的分析和有机
配合物的合成.
参考文献
1 尹卫平，等.中国药物化学杂志，1997，7(1)：46
2 尹卫平，等.中草药，1997，28(1)：3
3 尹卫平，等.新乡医学院学报，1995，12(4)：316
, 百拇医药
4 尹卫平，等.新乡医学院学报，1995，12(2)：116
5 周采菊，等.中草药，1996，27(9)：538
6 黄宗秀，等.中药材，1990，13(1)：32
7 北京大学生物系.生物化学实验指导.北京：北京人民教育出版社，1982：3
8 阎福林主编.医用化学实验技术指导.成都：成都科技大学出版社，1998：3
9 中国科学院上海药物研究所编著.中草药有效成分提取与分离.上海：上海科学技术出版社，1983：7
收稿日期：1998-12-15, 百拇医药
单位：新乡医学院化学教研室(456003)
关键词：无花果；糖类化合物；o-T比色法
中草药991111摘 要 建立了o-T比色法测定无花果中糖类化合物的含量测定方法，波长630 nm，线性范围0.2～2 mg/mL， RSD=4.6%，回收率99.47%。该法显色灵敏，不必沉淀蛋白质，不受还原性物质的干扰，较其它方法操作简便，方法特异，准确，重复性好。既能测定总糖，还能测定还原糖，从而间接地得出多糖的含量，适用于中草药中糖类化合物含量的测定。
无花果Ficus carica L. 为桑科榕属植物，具有健胃清肠，消食解毒之功效。其果实含有抗癌有效成分〔1～4〕和多种营养成分。其中糖类化合物是主要营养成分之一。目前糖的测定方法已有报道〔5～7〕，但有的只能测定总糖，不能排除还原性物质的干扰或操作繁琐或结果误差大等。我们采用邻甲苯胺法测定无花果中糖类化合物含量，结果满意。
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1 仪器及试剂
CL-770 分光光度计(日本岛津)，7230型分光光度计(中国上海)。
样品为采自河南省豫北地区的无花果熟果、幼果及叶的烘干粉末(60～100目)。所用试剂均为分析纯，标准品：葡萄糖2 mg/mL。
o-T试剂：940 mL冰乙酸中加入1.5 g硫脲，60 mL邻甲苯胺混合，直至硫脲完全溶解，置棕色瓶中，室温保存24 h后使用。
2 方法与结果
2.1 实验方法：取样品1 mL，加入o-T试剂5 mL，沸水浴30 min，取出冷水冷却，于630 nm处，用0.5 cm比色皿，以试剂空白调零测吸收度值。
2.2 条件实验
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2.2.1 吸收光谱测定：葡萄糖标准品与o-T试剂显色稳定后在CL-770分光光度计上测定吸收光谱，如图1所示，波长宽度(325～1100 nm)。由图可知，葡萄糖与o-T试剂反应后的最大吸收峰在630 nm处。
图1 葡萄糖与o-T试剂的吸收光谱
2.2.2 显色时间及稳定性：取试管7 支均加水解液1 mL、o-T试剂5 mL混匀置沸水浴中，分别在5，10，15，20，25，30，35 min分别取出冷却测吸收度，结果以煮沸30 min时吸收度值最大，冷却后30 min内显色稳定。
2.2.3 显色剂用量的选择：取试管7 支加标准液与显色试剂之比分别为1∶1～7，按上述方法沸水浴30 min冷却，结果两者之比为1∶5时吸收度最大，其它比例吸收度值均降低。本文采用5 mL。
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2.2.4 水解条件的选择：精密称取样品(熟果)0.5 g共7 份，分别加入2%，10%，15%，20%，30%，40%，50% HCl 50 mL，沸水浴水解并于10，20，30，40，50 min，1，1.5，2，2.5，3 h分别取出1 mL加o-T试剂5 mL同前试验，然后测吸收度值。结果用20% HCl水解30 min时，吸收度值最大，水解最完全。
2.2.5 标准曲线的制作：精密吸取葡萄糖标准液(2 mg/mL)0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，补充蒸馏水到1 mL，按实验方法显色，测吸收度值。求得回归方程为A=0.7819C+0.03614，r=0.9992。糖含量在0.2～2 mg/mL内服从比耳定律。
2.2.6 精密度：取水解后的同一样品一天内测定10 次，结果RSD=4.6%。
2.3 结果
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2.3.1 可溶性糖类化合物的测定：精密称取无花果熟果、幼果和叶的干燥恒重粉末0.25 g于试管中(平行做3份)，加入15 mL 80%乙醇，塞紧，50 ℃水浴提取30 min，倾出上清液，残渣再用80%乙醇提取3次，合并定容至100 mL，按实验方法显色测吸收度值，由回归方程计算含量。见表1。
表1 无花果可溶性糖含量测定结果 样品
熟果
幼果
叶
含量(%)
54.32
24.40
15.45
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2.3.2 总糖含量测定：精密称取无花果熟果、幼果及叶的干燥粉末0.25 g于60 mL圆底磨口蒸馏瓶中(平行做3 份)，加入20% HCl 20 mL，塞紧，沸水浴水解30 min，取出，冷水冷却，滴加甲基红指示剂一滴，用20% NaOH中和至微酸性(pH=6～7)，转移到100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，混匀过滤，以下按实验方法显色测吸收度值，由回归方程计算总糖含量。结果见表2。表2 总糖及多糖含量测定结果 样品
熟果
青果
叶
总糖含量(%)
62.08
31.56
29.54
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多糖含量(%)
8.76
7.16
14.09
2.3.3 回收率试验：精密称取熟果粉末0.25 g于蒸馏瓶中，加入1.0 mg葡萄糖，以下同总糖含量测定，结果回收率99.47%。
3 讨论
3.1 还原糖o-T试剂显色生成绿色溶液，在630 nm处有最大吸收峰，但从吸收光谱可以看出，在325～500 nm之间有更大吸收峰，所以作者将溶液稀释，使吸收光谱放大(如图2所示)，在325～500 nm之间为一群杂乱无章的吸收峰群，实际测定效果亦差。因此，本文选择了630 nm为测定波长。
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图2 葡萄糖与o-T试剂的吸收光谱
3.2 葡萄糖与o-T试剂沸水浴显色10 min时吸收度值最大，延长时间略有降低，但水解液与o-T试剂沸水浴显色30 min吸收度值最大，由于无花果中不但含有葡萄糖，而且还含有其它一些还原糖，为了使实验方法与标准曲线中方法一致，本文选用显色30 min。作者经实验表明葡萄糖与o-T试剂显色30 min所作的标准曲线求出的总糖含量与显色10 min相差无几，可以肯定，显色30 min对总糖测定无明显影响。
3.3 氧化亚铜法、Somogyi法、间接碘量等测定总糖多需除蛋白〔5～7〕再行测定，不仅操作繁琐，而且误差大，本实验方法不必沉淀蛋白质(作者作了对照实验)，减少了操作误差，显色灵敏，操作简便。但在水解后调pH时，不能调成碱性，应稍偏酸性，实验证实，调成碱性(或再用HCl调成微酸性)都降低显色后溶液的吸收度，使测量结果偏低。
, http://www.100md.com 3.4 Vit C是多种植物及果实中的重要营养成分，在碱性条件下具有较强的还原性〔8〕，常干扰碘量法、氧化亚铜法、Somogyi法等总糖测定，使结果偏高，本法利用o-T试剂在强酸性环境中加热与糖类的醛基所发生的反应，不受Vit C的干扰，经作者证实样品含有90 mg/100 g Vit C不影响本实验，因此该法较前几种方法特异，准确。
3.5 多糖类化合物是多种中草药的有效成分之一，某些多糖还具有抗癌、抗炎、抗病毒、提高免疫力等作用〔9〕，而多糖多无法直接测定〔6〕。本法既能测定总糖，还可测定还原糖，二者之差即为多糖，这样可粗略估计中草药中多糖的含量，有利于制剂的质量评定。
3.6 从实验结果可以看出，无花果熟果糖量较高，幼果与叶中糖量无多大差别，其可溶性糖类的定性鉴别，有待进一步继续研究。
致谢：在本实验的研究过程中，得到了尹卫平博士的亲自指导，在此表示感谢。
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基金项目：河南省科委资助课题
作者简介：张积霞，女，33岁，河南新乡医学院临床医学本科毕业，实验师，1987年分配
至新乡医学院化学教研室从事教学和科研工作，曾获厅级科研成果奖两项，在
正式刊物上发表学术论文7篇.目前研究的方向：中草药有效万分的分析和有机
配合物的合成.
参考文献
1 尹卫平，等.中国药物化学杂志，1997，7(1)：46
2 尹卫平，等.中草药，1997，28(1)：3
3 尹卫平，等.新乡医学院学报，1995，12(4)：316
, 百拇医药
4 尹卫平，等.新乡医学院学报，1995，12(2)：116
5 周采菊，等.中草药，1996，27(9)：538
6 黄宗秀，等.中药材，1990，13(1)：32
7 北京大学生物系.生物化学实验指导.北京：北京人民教育出版社，1982：3
8 阎福林主编.医用化学实验技术指导.成都：成都科技大学出版社，1998：3
9 中国科学院上海药物研究所编著.中草药有效成分提取与分离.上海：上海科学技术出版社，1983：7
收稿日期：1998-12-15, 百拇医药